MRC-5 人胚肺细胞的多重性能研究

MRC-5人胚肺成纤维细胞介绍

MRC-5 人胚肺细胞是人胚肺成纤维细胞，核型为正常二倍体（46，XY），贴壁生长，呈长梭形或纺锤状形态。可进行体外传代培养，对多类病毒敏感。自建株以来用于多种病毒性疫苗的生产和检定，得到了良好的安全性验证，如水痘疫苗、 带状疱疹疫苗、甲肝疫苗及狂犬疫苗。但MRC-5 人胚肺细胞作为二倍体细胞，具有一定的传代寿命，超过一定代次细胞衰老，与传代细胞相比难以大规模生产。因此提高细胞状态和使用代次对该细胞的产 业化应用具有重要意义^[1]。但在特定的病理需求下，也需要抑制MRC-5 人胚肺细胞的生长。

pH稳定性与CO₂分压如何改写传代终点

在贴壁细胞的静置培养中，pH控制是一个容易被低估的变量。悬浮培养或生物反应器培养可以通过在线监测与反馈调节将pH维持在较窄的波动区间，但方瓶、转瓶和细胞工厂等贴壁培养方式缺乏同等的控制精度，培养液pH在很大程度上取决于碳酸氢盐缓冲体系与外部CO₂分压之间的平衡。

在不同pH值培养液中培养人胚肺二倍体MRC-5 人胚肺细胞，观察其生长情况，选出最有利于MRC-5细胞生长的pH值范围。方法：采用细胞培养技术，分别在pH值为6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6的培养液中培养MRC-5细胞，通过显微技术观察细胞形态、对细胞进行计数，然后对MRC-5细胞的生长情况进行分析比较。结果在不同pH值的培养液中，MRC-5细胞的生长状况不同，细胞数量和细胞形态都有差异，当培养液的pH值为7.2—7.3时，细胞生长形态最好，细胞数量最高可达2.37×10⁶/ml^[3]。

在CO₂的使用和pH稳定性对MRC-5 人胚肺细胞增殖、传代培养及产毒水平的影响的相关研究中。采用不同浓度的NaHCO₃调节细胞培养液pH值，结合CO₂使用，监测细胞培养过程中pH变化情况，以及在连续传代过程中的细胞形态和增殖情况。接种水痘-带状疱疹病毒比较不同状态下细胞的产毒能力。采用碳酸氢盐缓冲体系时，无CO₂分压的封闭培养组细胞培养液pH波动较大，在传代培养中观察到细胞形态较差，细胞状态下滑快，细胞连续传代至35-37代，细胞在31代平均产毒水平4.64 Lg PFU/mL。有CO₂分压的开放组细胞培养液pH相对平稳，在传代培养中细胞活率维持80%以上，细胞状态下滑趋势平缓，可连续传代至41代，31代细胞平均产毒水平4.83 Lg PFU/mL。采用碳酸氢盐缓冲体系的细胞培养液匹配合适的CO₂分压有助于细胞状态的优化提升^[1]。

实验通过监测贴壁细胞MRC-5 人胚肺细胞静置培养过程中的pH动态变化，发现不恰当的培养方式会导致细胞在延滞期和对数期早期受到损伤，并且这种损伤会在连续的传代培养中积累。而通过调节NaHCO₃浓度与CO₂分压的使用，可以明显提高MRC-5 人胚肺细胞状态和连续传代能力^[1]。

白藜芦醇对MRC-5 人胚肺细胞周期抑制

以上讨论了如何维持MRC-5的正常生长程序，也有研究讨论如何抑制MRC-5 人胚肺细胞的生长。肺纤维化的病理机制是通过肺成纤维细胞的异常增殖与胶原过度沉积，如果能够找到抑制这一增殖过程的分子，便可能为抗纤维化治疗提供对应的方案。

研究探讨白藜芦醇(Res)对MRC-5 人胚肺细胞生长的抑制作用及相关机制。以MRC-5 人胚肺细胞为研究对象，分别予20 μL二甲基亚砜(DMSO)及0、12.5、25、50、100、200 μmol·L⁻¹ Res处理细胞24、48、72 h，通过MTT法分析细胞增殖抑制率。另外，以加入DMSO(溶媒组)及50、100 μmol·L⁻¹ Res孵育细胞48 h，采用流式细胞术检测细胞周期和凋亡率，行原位缺口末端标记法(TUNEL)测定细胞凋亡指数(AI)，应用荧光实时定量PCR和Western blot分别检测细胞周期蛋白D1(cell cycle protein D1，Cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4) mRNA与蛋白表达，Western blot检测Bcl-2、Bax蛋白表达。结果显示，随着Res浓度的升高和处理时间的延长，细胞增殖抑制率逐渐增加(P<0.01)。在共同培养48 h后，50、100 μmol·L⁻¹ Res处理组S、G₂/M期DNA比例及Cyclin D1、CDK4 mRNA与蛋白表达水平、Bcl-2蛋白表达水平降低，而G₀/G₁期DNA比例、AI、凋亡率及Bax蛋白表达水平增加，与溶媒组比较，差异均有显著性(P<0.01)，并且100 μmol·L⁻¹ Res效果强于50 μmol·L⁻¹(P<0.01)。实验结论为，Res能抑制MRC-5细胞增殖，其机制可能与阻碍细胞周期进展及促进细胞凋亡有关^[2]。

代次管理与控制

实操中需特别注意，由于MRC-5 人胚肺细胞是有限细胞系，不应将其当作可无限传代的细胞来使用。在开展长期实验或生产前，应提前规划代次空间，避免在关键阶段因细胞衰老而被迫中断。复苏后建议连续传代2–3次，待细胞状态稳定、生长曲线进入对数生长期后再用于正式实验或生产。代次限制是MRC-5用于生产的刚性约束。根据《中华人民共和国药典》的相关规定，MRC-5用于疫苗生产时，主细胞库代次应不超过第23代，工作细胞库代次不超过第27代，生产用细胞代次不超过第33代。这与该细胞约42–46次群体倍增的衰老极限相呼应，要求在实际工作中严格控制传代历史。

结语

MRC-5 人胚肺细胞的有限性既是它的定义性特征，也是理解围绕它展开各类研究的基础。疫苗生产要求尽可能延长其可用代次，纤维化机制研究与药物筛选则需要主动干预其增殖程序。两者说明，MRC-5 人胚肺细胞的增殖与衰老并非不可调控，培养微环境的化学参数与外源信号分子都能左右其细胞周期。

参考文献

[1] 张伊丽, 刘照平, 陆敏依, 等. CO₂分压对贴壁细胞MRC-5连续传代培养的影响[J]. 生物技术通报, 2019, 35(10): 169-173. 

[2] 刘理静, 钱红, 张平, 等. 白藜芦醇对人胚肺成纤维细胞株MRC-5生长的抑制作用[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(5): 673-679. 

[3] 陈通威, 赵鹏. 不同pH值对人胚肺二倍体成纤维细胞MRC-5生长的影响[J]. 山西医科大学学报, 2014, 45(5): 347-349.