UBE1L抗体在肺癌和肿瘤中的应用探讨

UBE1L是ISG15类泛素修饰系统的关键激活酶，与UBA7为同一基因产物。它位于染色体3p21，而肺癌患者中3p21缺失并不罕见。正常肺组织和肺细胞中能检出UBE1L，肺癌患者癌组织中的UBE1L明显低于邻近正常组织，14个肺癌细胞系中甚至检测不到，因此UBE1L被视为3p21.3位点上的候选肿瘤抑制基因^[1]。与之呼应的是，在人骨髓瘤细胞株RPMI-8226中，沙利度胺作用后ube1l同样被列入表达上调的基因^[2]。UBE1L抗体是用于检测UBE1L蛋白的免疫学工具，在生物医学研究中具有重要应用价值。

两项研究提供的证据并不处在同一层级。骨髓瘤研究采用含1152条人类基因的cDNA表达谱芯片，将沙利度胺处理前后的mRNA分别以Cy3、Cy5标记后杂交，筛出22个差异表达基因，其中18个上调，ube1l（编码泛素激活酶E1相关蛋白）是明显上调的5个基因之一^[2]。该研究的路径全部停留在mRNA层面，未对UBE1L蛋白本身做任何检测。ISG15修饰本身是一套多酶级联反应，UBE1L负责激活，UbcH6、UbcH8负责结合，EFP负责连接底物，UBP43负责解离^[1]，芯片捕捉到的只是其中一环。肺癌研究则从逆转录PCR一路做到免疫印迹，引物合成后，扩增退火65 ℃、35个循环，蛋白层面又在Beas-2B与A549细胞及非小细胞肺癌术后组织与癌旁组织中逐一比对^[1]。这些结果说明UBE1L抗体可提供判读的免疫印迹条带，是其存在的重要意义。

在Beas-2B细胞中，以0.5、5、10 μmol/L姜黄素处理24 h后，UBE1L抗体给出的条带呈剂量依赖增强。10 μmol/L处理6、12、24 h，12 h与24 h点相对对照升高逾2倍。同一批实验中，过表达UBE1L使内源性与外源性EGFR蛋白同步下降，却几乎不影响EGFR的mRNA，表明作用发生在翻译后水平。用CHX（40 μg/ml）阻断蛋白合成后，转染UBE1L组的EGFR下降速率明显快于对照。而以siRNA敲减UBE1L后，EGFR蛋白回升，姜黄素引起的EGFR下调随之被逆转^[1]。在A549肺腺癌细胞中，5、10、20 μmol/L姜黄素同样使EGFR蛋白随浓度下降。非小细胞肺癌术后标本中，UBE1L抗体显示癌组织UBE1L低表达或不表达，而EGFR、pAKT与NF-κB p65普遍高于癌旁^[1]。

同一论文里，UBE1L抗体被用于三种截然不同的场景，条件也各不相同。免疫印迹以5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗按1:1000稀释于5%封闭液，4 ℃与膜共同孵育过夜，TBST洗涤10 min共3次，HRP标记羊抗兔或羊抗小鼠二抗1:1000室温孵育1 h，ECL显色后X光片曝光。免疫荧光以4%多聚甲醛固定10 min，山羊血清封闭1 h，一抗1:100，37 ℃过夜，Alexa Fluor 488二抗1:200。免疫共沉淀则是取500～1000 μg总蛋白加10 μl一抗，4 ℃孵育2 h，再加protein A/G-plus琼脂糖4 ℃摇床过夜，以同种属IgG设空白对照^[1]。变性条带、固定后的原位构象、天然构象沉淀，对表位可及性的要求依次提高，同一产品的UBE1L抗体能否跨场景复用，须在选型阶段就分开验证。

从骨髓瘤的基因芯片和肺癌的细胞与临床组织，UBE1L的表达证据沿转录本、蛋白、组织定位逐级递进，每一级都需要相应的检测手段跟上。芯片与逆转录PCR给出趋势，组织学给出分布，只有免疫印迹能给出酶本身的丰度变化。同时，较低浓度的姜黄素、EGCG与白藜芦醇可诱导UBE1L蛋白表达，浓度升高后反而下降，这种双向剂量效应意味着抗体需要覆盖的丰度区间比常规检测更宽^[1]。对研究肺癌化学预防机制、或关注ISG15修饰系统的实验室而言，表位清晰、批间稳定、能在免疫印迹、免疫沉淀与免疫荧光中给出可重复结果的UBE1L抗体，是把理论往前推一步的基础配置。相应地，实验记录中保留抗体批次、稀释比与判读阈值，也能让后续的横向比较有据可依。

参考文献

[1] 江阿沛. 姜黄素对肺癌相关因子EGFR、UBE1L和RARβ调节作用机制研究[D]. 南京: 南京医科大学, 2014.

[2] 王怀宇, 张梅, 贺鹏程, 等. 人骨髓瘤细胞株基因表达谱经沙利度胺诱导的变化[J]. 中国实验血液学杂志, 2010, 18(2): 396-402.