荧光胺定量检测纳米SiO2表面氨基的含量

介绍

荧光胺（Fluorescamine）是一种本身不具荧光性质的螺环化合物，分子式为C₁₇H₁₀O₄，能与伯胺类物质（如氨基酸、肽和蛋白质）在室温下快速反应，生成具有强烈荧光的衍生物。其反应在pH 8.5–9.5的碱性条件下进行，生成的荧光产物最大激发波长为390 nm，最大发射波长为475 nm。由于荧光胺本身及其水解产物均不发光，该试剂具有低背景干扰的优势，且检测灵敏度比茚三酮法高10–100倍，广泛应用于氨基酸、蛋白质和蛋白水解酶的荧光检测，以及高效液相色谱柱前衍生和蛋白质测序分析等领域。

图一 荧光胺

检测微球表面氨基含量反应原理

荧光胺定量检测纳米SiO2SiO2微球表面伯胺含量原理如图二(1)、(2)所示，由于荧光胺与伯胺单独存在时并不具有荧光性,而二者在室温下水溶液中相遇容易发生特异性反应,其产物具有强荧光特性,过量的荧光胺遇水发生水解,水解产物也不具有荧光性,因此根据已知加量荧光胺与伯胺分子含量制定标准曲线,即可检测标准曲线范围内微球表面伯胺含量,最低检测极限能达皮摩尔级别。

荧光胺的丙酮溶液与磷酸盐缓冲液体积比对体系荧光测量的影响

由于荧光胺遇水易水解,在一定极性溶剂中与伯胺相遇能快速反应生成荧光活性衍生物,根据此特性,需要在测试荧光信号之前将荧光胺的丙酮溶液与一定pH值的磷酸盐缓冲液混合均匀，使其二者充分反应以使测试信号达到最强，图4所示为不同0.5mmol/L荧光胺的丙酮溶液与pH值为10.0的0.2 mol/L磷酸盐缓冲液混合后测试体系的照片，由图可以看出，当含有0.5 mmol/L荧光胺的丙酮溶液与磷酸盐缓冲液体积比为0.9/2.1,0.8/2.2,0.7/2.3时体系出现白色絮状沉淀,且丙酮体积越大,絮状沉淀越多,短时间内不消失,在二者体积达到0.6/2.4和0.5/2.5时混合液变澄清;以上原因可能是由于丙酮与水的极性不同,当荧光胺与伯胺在混合溶剂中相遇后快速反应生成具有荧光活性的衍生物,该物质带有羟基和羧基,进而在极性较强的混合溶剂中溶解性较大,因此,随着混合溶剂中水含量的增多,混合溶剂极性增强,衍生物溶解性增大,当达到一定阈值后体系变澄清,该现象在其他文献未见报道,本文后续荧光测试实验选择荧光胺的丙酮溶液与缓冲液比例均为0.5/2.5(1/5)。

图二 APTES 与荧光胺反应衍生物荧光激发谱图(a),发射谱图(b)

缓冲液 pH 值对氨基定量检测的影响

荧光胺与伯胺反应具有一定的pH依赖性，混合溶剂pH值的大小对荧光信号的稳定性和强度具有较大影响，因此本文选择0.2mol/L磷酸盐缓冲液pH值为6.0~12.0作为研究范围。由图5缓冲液pH值对荧光强度的影响曲线可以看出，荧光信号强度随着pH值的增加先增大，达到最大值后缓慢下降，在pH值为10.0时，体系荧光信号最强，因此本文选择磷酸盐缓冲液pH值为10.0作为定量检测纳米微球表面氨基含量反应体系的pH值大小。最佳pH值分别为8.5和10.0，可能与所检测伯胺化学物的性质不同所导致。

反应时间对氨基检测的影响

荧光胺与伯胺一相遇即反应生成具有荧光性质的衍生物，且随着反应时间的增加，相对荧光强度先快速增大，在反应8~10min达到最大值后趋于稳定，大于30min后略微下降。为了获取更加精确的结果，均采用二者在反应10 min时的数值[1]。荧光胺定量检测无机纳米SiO2表面氨基含量的方法, 在室温下, 荧光信号测试体系中荧光胺的丙酮溶液与磷酸盐缓冲液的体积比选择为1∶5, 磷酸盐缓冲液pH值10.0, 荧光胺与APTES反应时间为10 min作为该检测方法的测试标准，小粒径SiO2氨基含量值误差大于大粒径SiO2, 但其误差均小于3%, 该方法快速、精确和可靠。

参考文献

[1]宋汝彤,郭拥军,叶仲斌,等. 荧光胺定量检测纳米SiO2表面氨基的含量[J]. 硅酸盐通报,2017,36(12):4256-4261,4276.