磷脂酰胆碱(大豆)的分析检测及其活性研究

磷脂酰胆碱(大豆)是由亲水的磷酸脂基团和亲油的脂肪酸基团组成的两亲分子，因此具有很好的乳化性能，同时还具有调节血脂、降低胆固醇、强化脑部功能、增强记忆力、调节脂肪代谢、防治脂肪肝的功效。因此，磷脂酰胆碱(大豆)被广泛应用于食品、医药及化妆品等行业。

目前磷脂酰胆碱(大豆)含量的测定方法主要有紫外分光光度法、薄层层析法、核磁共振法、红外光谱法、高效液相色谱法、质谱分析法等，其中高效液相色谱法灵敏度高、稳定性和重现性好，是检测磷脂酰胆碱(大豆)最为有效的方法。而GB5009.272—2016《食品安全国家标准食品中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的测定》中使用的流动相为正己烷-异丙醇-乙酸水的混合溶液，由于某些高效 液相色谱仪的密封圈不耐正己烷，在使用该流动相时易受到限制。

检测方法

1、色谱条件

Eclipse Plus C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5um)；柱温35℃；检测波长205nm；以异丙醇-甲醇-水作为流动相等度洗脱；流速0.5 mL/min； 进样量20uL。

2、标准系列溶液的配制

2.1标准储备液的配制：称取磷脂酰胆碱(大豆)标准品适量，用10.0mL甲醇溶解并定容至50.0mL，得磷脂酰胆碱(大豆)标准储备液(2.3075mg/mL)， 密封后置于一20℃冰箱保存备用。

2.2标准工作曲线溶液的配制：分别吸取磷脂酰胆碱(大豆)标准储备液于10.0mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度线，配制成磷脂酰胆碱(大豆)质量浓度分别为0.4615、0.9230、1.3845、1.8640、2.3075mg/mL的标准工作曲线溶液，通过0.22um膜过滤，密封后置于一20℃冰箱保存备用。

2.3供试样品的制备

2.3.1样品前处理：根据磷脂酰胆碱(大豆)易溶于低级醇，而其他磷脂几乎不溶于低级醇的特点，选用乙醇作为磷脂酰胆碱(大豆)的萃取剂；称取0.5g大豆磷脂粉末于圆底烧瓶中，加入体积分数95％乙醇溶液4.0mL，以35℃萃取30min后，以6000r/min离心10min；取上层清液先在温度为35℃的旋转蒸发仪上旋转蒸发，之后用氮气吹干，备用。

2.3.2供试液的制备:：称取适量的乙醇提取物用5.0mL甲醇溶解后倒入25.0mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，通过0.22um膜过滤，密封后于一20℃保存备用。

3、方法验证

根据GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》建立校准曲线及校准曲线的T作范围。称取大豆磷脂样品，按照色谱优化后的方法，平行测定6次，计算磷脂酰胆碱(大豆)的相对标准偏差(RsD)，考察方法的重现性；根据大豆磷脂中磷脂酰胆碱(大豆)的含量，按本底值的0.5、1.0、1.5倍3个水平，进行加标回收率测定，以回收率的高低评价方法的准确度。

4、实际样品的测定

选取不同批次的大豆磷脂，按2.3.1的方法制备磷脂酰胆碱(大豆)，按1的色谱条件进行液相色谱分析，计算不同批次大豆磷脂中磷脂酰胆碱(大豆)的含量[1]。

活性研究

观察磷脂酰胆碱(大豆)对幼年大鼠海马结构突触素(SYN)的免疫表达和空间辨别性学习记忆能力的影响。方法:5wk龄雄性Wistar大鼠21只,随机分为3组:①磷脂酰胆碱(大豆)添加喂养组(PC,n=8);②迷宫对照组(MC,n=7);③正常对照组(NC,n=6)。喂养8wk,PC组和MC组大鼠在Morris水迷宫中进行连续4d的空间辨别性学习记忆能力检测,计算机分析系统自动记录逃避潜伏期(escape latency,EL)等相关参数,分析大鼠行为变化，用免疫组织化学方法检测PC、MC和NC各组大鼠海马结构SYN的免疫表达。结果:逃避潜伏期(EL):PC组与MC组比较,差异有统计学意义(P<0.01)，SYN免疫表达:PC组与MC组比较,大鼠海马结构各区SYN免疫反应阳性产物的吸光度值差异有统计学意义(P<0.01);MC组与NC组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:添加磷脂酰胆碱(大豆)喂养幼年大鼠,可促进其海马结构突触的增长,使SYN的免疫表达增强,提高了突触的可塑性,从而提高幼年大鼠的空间辨别性学习记忆能力[2]。

探讨奶粉中添加磷脂酰胆碱(大豆)对小鼠记忆力的影响。采用3周龄雌性昆明种小鼠48只,随机分为正常对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,磷脂酰胆碱(大豆)按0.1mL/10g体重给予灌胃,连续给样30d,进行跳台、水迷宫和避暗实验的训练,24h后进行24h测验,1周后进行消退实验。结果表明:水迷宫实验、跳台实验、避暗实验结果均为阳性,因此该项动物结果阳性。添加磷脂酰胆碱(大豆)的奶粉可改善试验小鼠的记忆,为功能性乳制品的研究与开发提供依据[3]。

参考文献

[1] 朱梦男,金日生,张华,等. 反相高效液相色谱法测定大豆磷脂中磷脂酰胆碱含量[J]. 粮食与油脂,2023,36(11):159-162. DOI:10.3969/j.issn.1008-9578.2023.11.034.

[2] 张建东,侯一平,宋焱峰,等. 大豆磷脂酰胆碱提高幼年大鼠学习记忆能力及海马突触素的表达[J]. 第四军医大学学报,2005,26(9):805-807. DOI:10.3321/j.issn:1000-2790.2005.09.011.

[3] 苏玉芳,梅连杰,刘彪,等. 添加大豆磷脂酰胆碱的奶粉对小鼠记忆力的影响[J]. 中国乳品工业,2010,38(1):29-30,34. DOI:10.3969/j.issn.1001-2230.2010.01.008.