5,10-亚甲基四氢叶酸的应用及合成

5,10-亚甲基四氢叶酸 (非对映体混合物) 是叶酸代谢通路中的关键中间辅酶，因C6位手性中心存在而天然形成非对映异构体混合物，淡米色至黄色固体；具强吸湿性，对光、热、湿度敏感；微溶于DMSO/甲醇。

生物功能与用途

1代谢角色‌：

作为亚甲基四氢叶酸还原酶 (MTHFR)‌的底物，被还原生成具有生物活性的 ‌5-甲基四氢叶酸 (5-MTHF)‌，参与同型半胱氨酸→甲硫氨酸的甲基供体循环；在胸苷酸合酶催化下，作为一碳单位供体参与 ‌dUMP → dTMP（胸苷酸）合成‌，支持DNA复制；介导丝氨酸与甘氨酸的可逆转化（丝氨酸羟甲基转移酶反应）。

2应用方向‌：科研试剂‌：用于叶酸代谢机制研究、MTHFR 酶活检测、药物代谢动力学（如作为 稳定同位素标记物 的前体）；‌质量控制‌：作为“叶酸杂质 13 单体”用于药品（如 甲氨蝶呤、5-FU 方案）中相关杂质对照；肿瘤研究‌：部分衍生物（如 ANX-510）曾探索用于调节 5-FU 细胞毒性，但非临床一线用药。

合成方法

1 进行四氢叶酸（100 μL）、Tris-HCl（pH 7.5； 50 mM）、KCl（100 mM）、MgSO₄（6.0 mM）、ZnSO₄（0.1 mM）、甲酸（10 mM）、甲醇（0.1%）、FAD（5.0 μM）、NADH（0.2 mM）、THF（2.0 mM）和醇氧化酶（0.2 U）进行反应。加入醇氧化酶以启动反应。在32°C下敞盖进行反应15分钟。每3分钟用移液管搅拌混合物一次，以通过醇氧化酶为甲醇氧化提供O₂。盖上盖子。继续孵育混合物10分钟，以消耗溶解的O₂，从而得到5,10-亚甲基四氢叶酸。[1]

2 进行Tris-HCl（pH 7.5； 50 mM）、KCl（100 mM）、MgSO₄（6.0 mM）、ZnSO₄（0.1 mM）、甲酸（10 mM）、甲醇（0.1%）、FAD（5.0 μM）、NADPH（4.5 mM）、NADH（0.2 mM）、叶酸（2.0 mM）的反应。加入醇氧化酶（0.2 U）以及保加利亚乳杆菌二氢叶酸还原酶（0.2 mg/mL）以启动反应体系。将反应体系在32°C下、敞盖条件下反应15分钟。每3分钟用移液管搅拌一次混合物。盖上盖子。将混合物继续孵育10分钟，以清除溶解的O₂。向混合物中加入甲酸脱氢酶（0.1 mg/mL）和5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（0.04 mg/mL）。将粗产物在32°C下孵育30分钟，以获得5,10-亚甲基四氢叶酸。

3 将适量固定化酶 FDH@COFLZU1、FDH@COF-TpPA 和 FDH@COF-TpBD 与纳菲昂溶液（5 wt% 全氟磺酸树脂）混合。将各酶-纳菲昂混合物涂覆于碳布上，制备用于生物电催化的工作电极。组装 H 型电解槽，并将制备好的碳布用作工作电极。使用铂片（5 mm × 5 mm × 0.1 mm）作为对电极，Ag/AgCl 电极（3.5 M KCl，6 × 65 mm，相对于 NHE 为 +198 mV）作为参比电极。用Nafion 115质子交换膜（Φ 30 mm，厚度0.125 mm）将阳极室与阴极室隔开。向阳极室中注入1 mM H₂SO₄。向阴极室中注入35 mL磷酸盐缓冲液（100 mM，pH 7.0），其中含有5 mM乙基维奥伦（EV）和5 mM NADH。在pH 7.0的缓冲液中进行生物电催化反应，以平衡CO₂的溶解度、酶活性及长期电化学稳定性。以40 mL min⁻¹的流速将CO₂持续通入阴极室。每2小时从阴极室中取样一次。过滤反应混合物，并使用高效液相色谱仪（Shimadzu LC-2020）进行分析。采用Shim-pack GIST C18色谱柱（5 μm，4.6 mm × 250 mm）进行HPLC分析，紫外检测波长为210 nm。将色谱柱和检测器温度维持在35°C，以5 mM H₂SO₄作为流动相，流速为1 mL min⁻¹，甲酸在2.3 min处洗脱。使用石墨电极（Φ 6 × 90 mm），在保持底部搅拌的同时，将固定量的固定化酶直接加入阴极室，其余所有反应和分析条件保持不变。通过循环伏安法监测电荷转移特性，以 20 mV s⁻¹ 的扫描速率从 -0.8 V 扫描至 0.2 V，重复六个循环，直至信号稳定，最终得5,10-亚甲基四氢叶酸。

参考文献

[1] Nishikawa, S., Yu, W. C., Chiang, Y. R., Wu, T. Y., Tang, I., Khusnutdinova, A., ... & Wang, P. H. (2025). Methanol-driven, one-pot chemoenzymatic S-adenosylmethionine regeneration for ambient cobalamin-dependent methyltransferase reactions. ACS Catalysis, 15(15), 13689-13703.