透明质酸酶纯化方案

透明质酸酶也叫玻璃酸酶。其可以降低组织黏度，提高毛细血管和组织的通透性，加速细胞内外物质的扩散，是一种重要的药物扩散剂。牛羊睾丸中提取的透明质酸酶与顶体酶混合存在。目前国内提纯该酶主要是传统的盐析方法，提纯纯度不高。生物分离介质作为纯化技术的新技术和新趋势，不仅生物相容性好，而且提纯精度高，可以达到较好的分离效果。

牛羊睾丸中的透明质酸酶分子量是6.1×104，为酸性蛋白酶，pI＜7.0。最适pH值4.0～7.5。顶体蛋白酶是中性蛋白酶，pI=7.0。可以用DEAE Bio-sep FF弱阴离子交换介质进行纯化。在pH=7.0时透明质酸酶带负电荷，顶体蛋白酶不带电荷。顶体蛋白酶不带电荷，不被介质吸附，在上样过程中流穿出来。透明质酸酶带负电荷被介质吸附，再用高盐浓度的缓冲液洗脱下来，从而达到两个酶分离纯化的目的。

纯化流程

1.准备填料。此填料的载量为80mg/ml(BSA)，粒径50~160um，流速450~750cm/h，耐压0.3Mpa。建议上样量控制在20~40mg/ml，流量（ml/min）计算为：450×柱子横截面积÷60，建议不要超过此值。（粒径、强度、载量可以调整和制定）。

2.装柱。把填料装到柱子，注意不要有气泡，柱子径高比控制在1:10~1:5，然后用蒸馏水把贮存液清洗干净，一般走8~10个柱体积。

3.平衡。用缓冲液20mM Tris-HCl，pH7.0平衡柱子，直到流出液的pH和电导稳定，一般走10~15个柱体积。

4.样品的准备。可以把预处理后的样品，经过超滤、透析、G-25脱盐等置换成和平衡缓冲液一样的体系。

5.上样。根据填料体积确定上样量，一般为介质体积的1/30，用合适的流速把样品流经柱子，收集流穿液。上样后，透明质酸酶吸附在柱子上，而顶体蛋白酶直接流传下来。

6.淋洗。用平衡液流经柱子，直到pH和电导保持不变。

7.洗杂。用20mM Tris-HCl缓冲溶液加5mM氯化钠，pH7.0，流经柱子，直到pH和电导保持不变。

8.洗脱。用20mM Tris-HCl缓冲溶液加上不同浓度的氯化钠200mM、250 mM、300 mM、400 mM、500 mM、1M、2M，pH7.0分别流经柱子，每个洗脱液洗8个柱体积，分别收集，统一分别检测，确定哪个浓度的氯化钠洗脱更为合适。

9.柱子的再生处理。洗脱完后，先用2M的氯化钠洗3~5个柱体积，再用0.1M氢氧化钠洗3个柱体积，然后水洗至中性，再用20%乙醇过柱子。将填料保存于20%乙醇溶液。