主要分子生物学试剂和培养基

以E.coli JM109基因组为模板，分别以pQE-nlpE-F和pQE-nlpE-R、pQE-spy-F和pQE-spy-R为引物，通过高保真PCR扩增获得2个基因片段，大小分别为711 bp和486 bp。PCR程序：95 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min，16 ℃ 30 s。

实时荧光定量PCR过程中所使用的DNA聚合酶SYBR® Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus) (2×Conc.)、高保真DNA聚合酶PrimerSTAR®以及限制性内切酶均购自大连宝生物有限公司，一步克隆连接酶Exnase Ⅱ购自南京诺唯赞生物科技有限公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小量制备试剂盒以及PCR产物纯化试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司，其他材料和所用试剂为国产分析纯。引物由苏州泓迅生物科技有限公司合成，基因测序服务由赛音生物技术(上海)有限公司提供。LB培养基：酵母提取物0.5%，胰蛋白胨1.0%，NaCl 1.0%，1×105 Pa灭菌20 min。

DNA制备：将过夜活化后的E. coli JM109按照1% (V/V)的接种量转接至30 mL新鲜LB液体培养基中，于37 ℃、120 r/min培养至OD600约为0.8时，向摇瓶中添加不同浓度(0.2%–0.8%，V/V)丁醇，继续培养90 min后，吸取菌液2 mL，于5510×g室温离心2 min，倒出上清培养基收集菌体，进行RNA的抽提。通过一步法cDNA合成(逆转录)试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)合成对应的cDNA。

荧光定量PCR：以上述cDNA为模板，以qPCR-rcsB-F/R、qPCR-cpxR-F/R、qPCR-baeR-F/R、qPCR-pspA-F/R、qPCR-rpoE-F/R为引物(表 1)，采用SYBR®Green Ⅰ嵌合荧光法(大连宝生物工程有限公司)，SYBR®Green Ⅰ与双链DNA结合后发出荧光，通过检测PCR反应生成双链DNA与SYBR®Green Ⅰ结合发出的荧光强度，从而可以达到对目的基因进行准确定量的目的，反应体系参照试剂盒说明。

使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制性内切酶对pQE80L载体进行双酶切线性化，酶切条件为37 ℃酶切6–8 h。

将PCR扩增带有同源臂的nlpE和spy基因片段与通过BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制性内切酶双酶切后的pQE80L载体通过一步克隆酶法连接体系(南京诺唯赞生物科技有限公司)连接，构建质粒pQE80L-nlpE和pQE80L-spy(图 1)。一步克隆连接体系为：50–200 ng线性化pQE80L，20–200 ng插入片段，2 μL 5×CE Ⅱ Buffer，1 μL Exnase Ⅱ。连接体系置于37 ℃反应30 min，待反应完成后置于冰上冷却5 min，通过化学转化方法将连接产物转入E. coli JM109感受态细胞，并涂布在含有卡那霉素的固体平板。次日通过菌落PCR初步验证平板阳性单菌落，将验证出的阳性转化子测序验证。

分别以spy-K-F/R和nlpE-K-F/R为引物，以质粒pKD13为模板扩增带有同源臂的FRT-Kan-FRT片段(约1450 bp)，通过电击法将含有同源臂FRT-Kan-FRT片段转入含有pKD46的E. coli JM109感受态中，使其整合到E. coli JM109基因组上。将验证成功的阳性重组子按照化学转化感受态细胞的制备方法制备成感受态细胞，并将质粒pCP20电转入感受态细胞中，30 ℃过夜静置培养，再通过42 ℃高温培养10 h以消除质粒pCP20。

将过夜活化的重组菌按照1% (V/V)的接种量转接至30 mL新鲜LB液体培养基中，于37 ℃、120 r/min培养菌体至OD600到达0.6时，添加终浓度为0.2 mmol/L的IPTG，于30 ℃诱导培养6 h，在4 ℃、8801×g离心10 min收集菌体。在超声破碎仪上进行超声破碎15 min (超声1 s，间歇3 s，500 W)，破碎液进行SDS-PAGE分析蛋白表达状况。

将重组菌和带有pQE80L的E. coli JM109 (对照菌)经转接诱导培养(0.2 mmol/L IPTG)至OD600达到为0.8时，将0.8% (V/V)正丁醇加入到细胞培养液中，30 ℃、120 r/min培养10 h。其间每隔2 h取样通过分光光度计OD600读数监测菌体的生长状况。

采用细胞粘着碳烃化合物法(microbial adhesion to hydrocarbons，MATH)来测定细胞表面疏水性变化。根据重组菌耐受性测定的方法，将过夜活化后的对照菌株E. coli JM109/pQE80L和重组菌株E. coli JM109/pQE80L-nlpE、E. coli JM109/pQE80L-spy经转接诱导培养(0.2 mmol/L IPTG) 6 h，在4 ℃、8801×g条件下离心10 min收集菌体。彻底吸取培养基，用0.1 mol/L的磷酸钾缓冲液(pH 6.0)悬浮细胞，控制初始OD400值为0.8–0.9 (A0)。吸取4.8 mL菌液与0.8 mL溶剂充分混匀，室温静置15 min，分层后取水相样品测定其OD400值(A1)。粘附率用公式(1)计算。

分子生物学和蛋白质表达用微生物培养基产品：