醉椒素的应用

背景及概述^[1]

卡瓦胡椒(PipermethysitcumForster)为多年生灌木类药用植物，主要分布于南太平洋诸岛国，如新几内亚、密克罗尼西亚、斐济、玻利尼西亚等。现代药理学研究表明，卡瓦胡椒具有抗焦虑、镇静催眠、肌肉松弛、局部麻醉、抗炎抗菌等作用，因其无成瘾性，耐受性好等优点，近几年来成为美国和德国最畅销的草药之一，仅2000年在美国的销售额就高达1950万美元。

卡瓦胡椒的主要成分为α-吡喃酮类化合物，称之为卡瓦内酯。卡瓦内酯在卡瓦根中的含量各异，为3％-20％，占总提取物的25％-70％，其中最主要的6种内酯是：醉椒素[(+)-醉椒素，含量1.8％]、亚甲二氧基醉椒素[(+)-Methysticin，含量1.2％]、去甲氧基甲氧基醉椒素[(+)-Desmethoxyangonin，含量1％]、甲氧基醉椒素[(+)-Yangonin，1％]、二氢醉椒素[(+)-Dihydro醉椒素，0.6％]和亚甲二氧基二氢醉椒素[(+)-Dihydromethysticin，0.5％]。

醉椒素(醉椒素)是从卡瓦胡椒根中提取的活性成分，曾有研究显示，醉椒素对平滑肌膜有非特异性亲肌作用，赵淑彦等研究结果表明，醉椒素舒张呼吸道平滑肌的作用可能是通过抑制M₃受体和钙通道，减少Ca²⁺内流产生的。

应用^[2]

醉椒素是从卡瓦胡椒的根部提取的有效成分，具有抗炎和抗氧化作用，醉椒素及其衍生物目前被用于治疗神经疾病，用作松弛剂、镇静剂和抗焦虑药。醉椒素在制备治疗骨质疏松药物方面的应用。醉椒素通过抑制钙介导的NFATc1和MAPK信号通路抑制破骨和骨吸收，同时还发现醉椒素治疗可以减轻OVX小鼠的骨丢失。众所周知，M-CSF和RANKL是启动破骨细胞分化并刺激其骨吸收功能的主要细胞因子。NFATc1是促进破骨细胞分化的主转录因子，是在RANKL/RANK轴激活后诱导的。

NFATc1的表达依赖于肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)以及NF-κB、MAPK和钙信号通路。反过来，NFATc1调控使破骨细胞附着在骨上并介导其骨吸收功能的靶基因的表达。以往的研究中，醉椒素及其衍生物分子被建议调控LPS诱导的信号通路，如NF-κB、激活蛋白1(AP-1)和ERK。然而，醉椒素调控破骨细胞活动的确切机制未被探究。

有趣的是，发明人发现醉椒素可以抑制NFATc1和DC-STAMP的表达，这是一种破骨细胞融合前相关蛋白，并通过RNA和蛋白质分析，抑制下游效应ACP5(也称为TRACP)、CTSK、MMP9和整合素β3的表达。这些发现提示了醉椒素抑制破骨和骨吸收的机制之一。然而，发明人发现在加入醉椒素后NF-κB通路的激活没有改变，或许醉椒素对NF-κB通路影响的差异可能是由于细胞类型和培养体系的不同所致。

钙信号是另一种调节破骨细胞发生的关键途径，可被RANKL/RANK和磷脂酶Cγ激活，从而促进NFATc1的激活，特别是NFATc1可以在活性钙信号传递过程中被自动放大。在发明人的研究中，卡文抑制细胞内钙振荡。因此，抑制钙信号通路导致NFATc1失活可能是导致破骨细胞形成和活性下降的原因之一。MAPK通路作用于RANKL信号的下游。

MAPK活性通过主要的特异性丝裂原活化蛋白激酶(MAP2Ks)激活JNK、P38、ERK，参与MAPK磷酸化。例如，MEK1和MEK2负责ERK；MKK3和MKK6激活P38；MKK4和MKK7负责JNKs，而MKK4也参与P38磷酸化。MAPK通路和下游成分的激活促进破骨发生。在发明人的研究中，发明人证明醉椒素降低了JNK和P38的磷酸化，但减少了ERK的磷酸化。

相反，醉椒素在小鼠骨髓巨噬细胞中通过ERK2去磷酸化和髓系分化抑制肿瘤坏死因子-α的表达。肿瘤坏死因子-α反过来通过激活破骨细胞前体的RANKL信号来促进破骨发生。发明人推测，在同一细胞系中，不同的刺激条件下，所涉及的下游通路可能会转移。除此之外，醉椒素可能对特定的MAP2Ks产生不同的影响。这些差异背后的机制值得进一步研究。

骨髓间充质干细胞来源的成骨细胞也有助于骨重塑。成骨细胞可以表达关键的破骨细胞分化因子RANKL，并通过产生骨保护素来平衡其下游作用。骨丢失也可能是由于成骨细胞和破骨细胞数量的失衡或这两个细胞群体之间的沟通受损所致。以上研究结果表明，醉椒素可以抑制受体激活核因子-κB配体(RANKL)诱导的破骨细胞分化和融合，但对体外成骨细胞的分化和功能没有影响，提示醉椒素对破骨细胞具有细胞类型特异性作用。

总之，这些结果提示醉椒素通过调节细胞内钙介导的NFATc1和MAPK失活而抑制破骨细胞的形成和功能，而不影响成骨细胞(图7)。此外，醉椒素还可以通过抑制破骨作用来抑制去卵巢引起的骨质疏松症。发明人的数据表明，这种天然化合物在治疗溶骨性疾病方面具有潜在的作用。

制备^[1，3]

方法1：一种醉椒素的分离纯化方法，该方法包括以下步骤：

(1)原料药材前处理：取卡瓦胡椒低温烘干，粉碎成粗粉；

(2)超临界萃取：将药材粗粉投入萃取釜中进行萃取，萃取条件为：压力18-30MPa，温度30-45℃，时间为2-4小时，再压力为4-8MPa，温度为40-50℃下解析；

(3)柱层析：取出萃取物，加热水分散后加入大孔吸附树脂柱吸附，流速为1-3BV/h，先以3倍柱体积的30％乙醇洗脱，再以5倍柱体积的50％-80％乙醇洗脱，收集50％-80％乙醇洗脱液；

(4)脱色：洗脱液加入活性炭，加入量为洗脱液量的1-5％；

(5)结晶：将脱色液减压浓缩析晶，粗晶再用乙醇-乙酸乙酯(1∶1)加热溶解，冷藏结晶，结晶物干燥得醉椒素。

方法2：一种从卡瓦胡椒中提取醉椒素的方法，通过以下技术方案实现的：

1）将干燥的卡瓦胡椒粉碎，过40目筛，加入8-15倍量的乙醇溶液，进行回流提取；

2）提取液过滤，滤液减压浓缩，浓缩液上大孔树脂柱，用3-5BV水→5-8BV60%-80%乙醇洗脱树脂柱，收集乙醇洗脱液；

3）洗脱液浓缩至原体积的1/7-1/5，放置析出结晶；

4）乙醇重结晶2-3次，干燥结晶得醉椒素。

主要参考资料

[1] CN201110117995.6一种醉椒素的分离纯化方法

[2] CN201810881742.8醉椒素在制备治疗骨质疏松药物方面的应用

[3] CN201410446384.X一种从卡瓦胡椒中提取醉椒素的方法