枯草(芽孢)杆菌酶的主要应用

背景及概述^[1]

枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)是芽孢杆菌属细菌所分泌的胞外碱性蛋白酶，属丝氨酸蛋白水解酶类。它催化水解蛋白质为氨基酸，在有机溶剂中也能催化多肽的合成。这些碱性蛋白酶具有重要的应用价值，被广泛应用于洗涤剂、制革及丝绸工业。产生这类酶的菌有地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌和南极嗜冷芽孢杆菌等。它们产生的酶分别被称为枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)Carlsberg、BPN.、E、BL、YaB等。对于枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)结构与功能的研究已有较长的历史，其蛋白结构、生化特性、催化机理等均有了较清晰的了解。这些酶的三维结构及编码基因都基本研究清楚。大部分枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)是由270多个氨基酸残基组成。

枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)BPN.与E的区别是43个氨基酸残基发生替换，Carlsberg与E在序列上的区别是89个氨基酸残基替换再加上第56位残基缺失，BL与BPN.的区别是在275个氨基酸残基上有103个残基替换再加上4个残基(160~163)缺失。南极嗜冷芽孢杆菌分泌的碱性蛋白酶酶原由419个氨基酸残基组成，成熟的酶蛋白由309个氨基酸残基组成，与嗜温枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)有52%的氨基酸序列相同。由于枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)的高分辨率的结构已经清楚，而且有合适的克隆、表达系统以及准确的定量分析酶的催化活性的方法，因此它是进行蛋白质工程研究的合适的对象。迄今为止对枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)所做的定位诱变已有400多个，在理论和应用上都取得了相当的进展和成功。另外，利用体外诱变和体外重组技术对该酶的改造也取得了一些很好的成绩。人们对细菌进行基因工程改造，其目的就是为了使产物高表达或获得性能改进的产物，这一目的在枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)中已经取得很多成功的例子

应用

草杆菌蛋白酶是一种非常重要的工业用酶。已广泛应用洗涤剂，化妆品和不对称催化合成。

酶的活性^[2]

酶的催化能力的大小是酶的一个关键指标，一般用Kcat/Km来表示酶的催化效率。将枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)E中的Lle31替换成val，可使Kcat提高几倍。枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)BL的vall04用肠r替换，催化四肤的活性大大提高，对酪蛋白的水解也提高26%。

酶的专一性^[2]

通过改变枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)的残基，可以对酶的专一性施加影响。将位于枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)S1结合口袋的残基Glul56和Gly166借助定位诱变改变Gly166侧链体积和疏水性，或结合对lGul56赋予不同荷电性质时对酶的底物专一性产生很大影响。

酶的抗氧化能力^[2]

由于枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)的抗氧化能力较差，当受到氧化剂(增白剂、消毒剂)作用时，会立即失去90%的酶活力。因此添加此酶的洗涤剂不能再加增白剂和消毒剂等氧化剂。通过蛋白质工程手段改造枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)，可使其抗氧化能力提高。

酶在洗涤剂中的稳定性^[2]

将枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)组成疏水表面的氨基酸残基或者其附近的氨基酸残基中的至少一个替换为疏水氨基酸或疏水性更强的氨基酸，修饰后酶的氨基酸序列有80%一90%的同源性，这样修饰的酶具有对离子强度的稳定性，在一个洗衣循环中保持了活性。当将BABP92(南极嗜冷芽抱杆菌)所产的枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)的位于疏水区或疏水区附近的一个氨基酸替换为疏水性更强的氨基酸，突变酶提高了在洗涤剂中的稳定性和洗涤效果。尤其适用于液体洗涤剂和肥皂中.

酶的低温适用能力^[2]

日本和亚洲其它地区习惯于室温洗涤，因此室温洗涤是近年来对枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)提出的新课题。利用蛋白质模型和X-射线晶体学方法已经了解从南极细菌产生的一些嗜冷酶的性质。研究表明嗜冷酶的残基分子内作用弱化，在一些情况下与溶剂的作用增强，从而导致更为柔性的分子结构，在催化时有更少的能量损失。

分离纯化^[3]

(1)枯草杆菌发酵液的制备；按照2%蛋白陈、1%麦芽糖、0.05%硫酸镁、0.02%CaC12、0.4%KH2PO4的比例配制3.5L酵培养基，装于5L酵罐中，调节pH为7，加人消泡剂，于115℃灭菌30min后，连接好装置，按1%接种量将种子培养基接人发酵罐中，37℃、200r/min培养72h。

 (2)枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)粗酶的制备

将发酵液于4℃、4000r/min离心20min，得发酵上清液。发酵上清液于4℃下进行6既饱和度硫酸按盐析过夜，4℃、4000r/min离心30min收集蛋白质沉淀，4℃下蒸馏水透析脱盐，透析酶液经冷冻干燥得到枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)粗酶粉。

(3)枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)的纯化

将0.5g蛋白粗酶粉溶于4ml0.01mol/LpH5.7PBS上样缓冲液中，4℃、80000r/min离心I0min后上清上样于经处理平衡的层析柱，并用上样缓冲液洗脱杂蛋白，流速为0.4ml/min。杂蛋白洗脱后，用O一0.5mol/LNaCI梯度洗脱液进行洗脱，流速为0.4ml/min，每min收集1管，紫外检测仪和记录仪检测记录蛋白峰，分别收集蛋白洗脱峰，并透析，测定酶活力。最后冷冻干燥为酶粉。

主要参考文献

[1] 枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)基因工程的研究进展

[2] 枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)的基因工程改性

[3] 枯草杆菌蛋白酶(枯草(芽孢)杆菌酶)的纯化及酶学性质