人关节滑膜成纤维细胞的应用

背景^[1-6]

人关节滑膜成纤维细胞源于手术取得人正常关节滑膜组织。滑膜是关节囊的内层，淡红色，平滑闪光，薄而柔润，由疏松结缔组织组成。关节腔内的所有结构，除关节软骨、半月软骨板以外,即便是通过关节腔的肌腱、韧带等均全部为滑膜所包裹。滑膜分泌滑液，在关节活动中起重要作用。正常滑膜分为两层，即薄的细胞层(内腔层)和血管层(内膜下层)，是血管丰富的关节囊内膜，贴附于非关节面部分，覆盖于关节囊内的骨面上，不在软骨面上，此部分称为边缘区或“裸区”。

滑膜呈粉红色，光滑发亮、湿而润滑，有时可见绒毛，内含胶原性纤维。滑膜细胞有A、B两型。巨噬细胞样A型细胞，表面有丝状伪足、浆膜内陷、囊泡、线粒体、溶酶体、胞浆纤维和高尔基体，具有吞噬功能；B型成纤维样滑膜细胞(FLS)，有高浓度的内质网结构，是介导RA关节破坏的主要细胞。

细胞特性：

1细胞来源于手术取得人正常关节滑膜组织。

2细胞鉴定：纤维连接蛋白（Fibronectin）或波形蛋白（Vimentin）免疫荧光染色为阳性。

3经鉴定细胞纯度高于90%。

4不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5细胞生长方式：成纤维样细胞，贴壁培养。

人关节滑膜成纤维细胞培养方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察Ⅱ型肺泡上皮细胞|细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

应用^[7][8]

人关节滑膜成纤维细胞可用于滑膜成纤维细胞中促炎因子IL-6、VEGF影响骨关节炎病情进展的实验研究：

IL-6、VEGF在膝骨关节炎患者关节滑膜和滑液中的表达及其意义目的:检测不同阶段的膝骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者关节滑膜组织和滑液中白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达情况,明确滑膜组织在OA发生发展过程中的作用,评价VEGF作为进展期OA标志的可行性。

方法:临床收集膝关节镜或关节置换手术患者的关节滑液和滑膜组织,根据X线平片的K-L分级进行分组。以K-L分级均为0级的单纯膝关节半月板损伤的患者作为对照组。酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测各组关节液中IL-6、VEGF的含量,免疫组织化学染色方法检测IL-6、VEGF在滑膜组织中的原位表达。

结果:K-LⅡ、Ⅲ级的关节滑液中IL-6水平显著增高,差异有统计学意义;而K-LⅣ级患者关节滑液中IL-6水平下降接近对照组。各实验组的滑液中VEGF水平逐级增高,明显高于对照组。OA滑膜组织普遍存在不同程度的炎症,滑膜色泽变暗红,组织增生,甚至呈绒毛样增生改变。免疫组织化学染色显示,IL-6在滑膜衬里层及衬里下层细胞表达;VEGF在在滑膜衬里层及血管平滑肌细胞表达。结论:关节滑膜参与了骨关节炎的病理过程,滑膜产生的IL-6、VEGF很可能就是导致滑膜自身炎症慢性化、持续化的主要因素。滑液中VEGF水平的持续升高可作为判断OA病情活动的一个指标。

第二部分IL-6对体外培养的滑膜成纤维样细胞生物学行为的影响目的:观察IL-6对体外培养的滑膜成纤维样细胞(fibroblastlike synoviocyte,FLS)生物学行为的影响,探讨滑膜组织参与关节软骨破坏的作用机制。首先对关节置换手术切除的OA滑膜组织作原代细胞培养,通过流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD14、CD90抗原的表达情况对细胞进行鉴定。

对3-5代的FLS分别予以不同浓度的IL-6、IL-1以及IL-6+IL-1刺激,ELISA法检测细胞上清液中VEGF、基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinases,MMP-13)的含量,逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测IL-6诱导的FLS中VEGF、MMP-13的mRNA表达。

参考文献

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[8]朱宝玉.滑膜成纤维细胞中促炎因子IL-6、VEGF影响骨关节炎病情进展的实验研究[D].中南大学,2009.