人疟疾抗体(ML Ab)ELISA试剂盒

背景^[1-6]

人疟疾抗体(ML Ab)ELISA试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系。

检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象；放置室温，轻摇均匀，待结晶完全溶解后再配置洗涤液。可将20ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释配置成400ml工作浓度的洗涤液，未用完的放回4℃3.20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

检测原理：人疟疾抗体(ML Ab)ELISA试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人疟疾抗体(ML Ab)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人疟疾抗体(ML Ab)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

样本处理及要求：

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品保存：样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融，标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

应用^[7][8]

人疟疾抗体(ML Ab)ELISA试剂盒可用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人疟疾抗体(ML Ab)的含量

疟疾仍是严重危害人类健康的寄生虫病。由于疟原虫抗药性的产生和扩散,以及蚊媒对杀虫剂产生抗性并逐渐蔓延,使得传统的疟防措施面临严峻挑战。研发安全、有效的疟疾疫苗是当今最有希望的疟疾防治方法之一。

疟疾相关流行病学调查以及实验室研究结果均表明,研制有效的疟疾疫苗是可行的。长期在疟疾流行区生活的居民体内可以产生针对疟疾的免疫力,在高疟区,10岁以上的人群极少发生重症疟疾。从长期生活在西非疟疾流行区的成年人体内提取的IgG,被动免疫治疗重症疟疾患儿,能使其外周血原虫密度降低99%。此外,给志愿者反复接种经辐照减毒的疟原虫子孢子,可使人体产生完全的保护性免疫力。

参考文献

[1]Efficacy of RTS,S/AS01E malaria vaccine and exploratory analysis on anti-circumsporozoite antibody titres and protection in children aged 5–17 months in Kenya and Tanzania:a randomised controlled trial[J].Ally Olotu,John Lusingu,Amanda Leach,Marc Lievens,Johan Vekemans,Salum Msham,Trudie Lang,Jayne Gould,Marie-Claude Dubois,Erik Jongert,Preeti Vansadia,Terrell Carter,Patricia Njuguna,Ken O Awuondo,Anangisye Malabeja,Omar Abdul,Samwel Gesase,Neema Mturi,Chris J Drakeley,Barbara Savarese,Tonya Villafana,Didier Lapierre,W Ripley Ballou,Joe Cohen,Martha M Lemnge,Norbert Peshu,Kevin Marsh,Eleanor M Riley,Lorenz von Seidlein,Philip Bejon.The Lancet Infectious Diseases.2011(2)

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[3]Randomized double-blind controlled Phase I/IIa trial to assess the efficacy of malaria vaccine PfCS102 to protect against challenge with P.falciparum[J].Vaccine.2010(40)

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[7]Spread and evolution of Plasmodium falciparum drug resistance[J].Toshihiro Mita,Kazuyuki Tanabe,Kiyoshi Kita.Parasitology International.2009(3)

[8]彭恒.多期联合疟疾疫苗抗原结构与免疫保护作用的研究[D].第二军医大学,2011.