荧光定量PCR分析服务

背景^[1-6]

荧光定量PCR分析服务是通过荧光定量PCR对相关基因位点及其表达水平进行检测的技术性服务。实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。

由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

原理：将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

检测方法

1.SYBRGreenⅠ法：

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

SYBR定量PCR扩增荧光曲线图

PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性）

2.TaqMan探针法：

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

应用^[7][8]

荧光定量PCR分析服务可结合生物芯片技术用于疾病快速诊断：

生物芯片技术是20世纪末发展起来的一项新技术。生物芯片是在微小面积上，利用微加工技术，并结合有关的化学合成技术制造而成的一种具有一定分子生物学检验功能的微型器件。分析和解释生物芯片上得到的信息，将在DNA结构与功能之间架起一道桥梁，进而推进生命科学的迅速发展。

首次将实时荧光PCR技术与微流控芯片技术相结合，设计了一款实时荧光PCR芯片。在此芯片中设计了一个坝状结构，芯片键合封装后在坝下面会形成一个1um的罅缝，此罅缝能从血液中分离出白细胞，细胞分离后再往此芯片中注入PCR反应液，实现在同一腔体中进行PCR反应。由于它在很小的腔体内进行PCR反应，能大大节省样品和试剂的使用量。

在此芯片上利用微加工技术，集成制作了微加热器和温度传感器。由于芯片本身是由硅片和玻璃片经阳极键合而成，有非常好的导热效果，而且没有使用具有较大热容的外置加热器件，从而提高了PCR反应的升降温速度，缩短了PCR反应总时间。加热器和温度传感器的集成化，使得我们设计的芯片温控、荧光检测平台得以微型化。

同时自主设计了针对此芯片的专用检测平台，该平台由注射泵系统、实时荧光信号采集系统和PCR温度控制系统等组成，能实现样品进样，PCR温度控制，实时荧光检测、检测结果分析及处理等功能。最后，将此实时荧光PCR芯片及其检测平台应用于强直性脊柱炎相关基因HLA-B27的检测，实验证明该芯片系统能快速准确的检测出血液中的HLA-B27基因，从而验证了此芯片系统的实用价值。

参考文献

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[8]肖性龙.多重荧光PCR与液相芯片高通量病原体检测体系的建立与应用[D].华南理工大学,2010.