Cytochrome C抗体(小鼠单抗)的应用

背景^[1-6]

Cytochrome C抗体(小鼠单抗)是用小鼠Cytochrome C为抗原制备而成的抗Cytochrome C小鼠单克隆抗体。克隆号为6H2.B4。Cytochrome C抗体可以用于免疫荧光、免疫组化、免疫沉淀和流式检测，但不适合用于Western检测。

Cytochrome C抗体(小鼠单抗)可以用于通过免疫荧光或免疫组化检测线粒体内的Cytochrome C的释放情况，以确定Cytochrome C释放和凋亡的相关性，或直接用Cytochrome C释放来判断细胞凋亡的状况。正常细胞Cytochrome C的染色集中在线粒体，而凋亡细胞的Cytochrome C则呈弥散分布。

Cytochrome C，即细胞色素C，是线粒体内电子呼吸链中的一个重要蛋白。Cytochrome C在进化上高度保守。当细胞发生凋亡时，细胞色素C会从线粒体中释放到细胞浆中，并且作为细胞凋亡的关键调控步骤。在细胞色素C和dATP存在的情况下，Caspase-9和Apaf-1可以相互结合，并促使Caspase-9激活。细胞色素C的释放和Caspase-9的激活对于激活其它的Caspase包括Caspase-3，以及导致后续的DNA片段化(DNA fragmentation)至关重要。

细胞凋亡的抑制蛋白，Bcl-2或Bcl-XL都可以抑制细胞色素C从线粒体的释放；而细胞凋亡的促进蛋白Bax，可以诱导细胞色素C从线粒体的释放。Cytochrome C从线粒体释放到细胞浆中常被作为细胞凋亡的一个重要指标。细胞色素c是一类在生物体中广泛分布的血红素蛋白,由亚铁血红素(heme)和细胞色素c蛋白前体(apocyt c)在细胞色素c成熟系统的作用下共价结合形成。细胞色素c主要作为电子载体或者氧化还原酶参与细胞的能量传递过程,如呼吸作用和光合作用。以Shewanella oneidensis为代表的Shewanella属细菌的标志是呼吸多样性,这大部分归功于其含量极其丰富的细胞色素c。

应用^[7][8]

可以用于通过免疫荧光或免疫组化检测线粒体内的Cytochrome C的释放情况，以确定Cytochrome C释放和凋亡的相关性，或直接用Cytochrome C释放来判断细胞凋亡的状况。正常细胞Cytochrome C的染色集中在线粒体，而凋亡细胞的Cytochrome C则呈弥散分布。

肌萎缩性侧索硬化(ALS)是常见的神经退行性疾病,在脑干,皮层和脊髓中的运动神经元逐渐退化,从而引起肌肉瘫痪。大多数患者在疾病发病后三至五年内死于呼吸衰竭。大部分ALS病例是散发性的(s ALS),而10%是家族性的(f ALS)。20%的f ALS由突变体超氧化物歧化酶1(SOD1)基因引起。最新研究描述了其他重要的ALS诱导突变,包括反应性反应DNA结合蛋白43(TDP-43)和染色体9开放阅读框架72(C9ORF72)。

越来越多的证据表明线粒体功能障碍在神经退行性疾病,包括亨廷顿舞蹈病,帕金森病,阿尔茨海默病和肌萎缩性侧索硬化症的发病机制中发挥重要作用。线粒体在氧化应激,线粒体自噬,谷氨酸兴奋性毒性和内源性凋亡途径中起关键作用。在ALS的转基因小鼠模型中,在运动功能障碍之前就存在线粒体的肿胀和空泡化。线粒体异常在疾病进展过程中逐渐发展。线粒体是决定细胞死亡和存活的主要细胞内细胞器。内源性凋亡途径在这个细胞器中启动,老化的和功能失调的线粒体通过线粒体自噬被清除。

最近,基因治疗成为一种有效的治疗手段,通过自我互补(sc)腺相关病毒(AAV)载体介导的人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)的研究已经显示其对ALS小鼠模型的积极治疗作用。用嗜神经的腺相关病毒血清9型(AAV9)携带编码双链的人IGF-1基因(scAAV9-hIGF-1)作用于TDP-25稳转细胞系及经肌肉注射的途径干预G93A-SOD1转基因小鼠,观察到在体内和体外实验中,通过上调抗凋亡蛋白(Bcl-xl,Bcl2)的表达和下调促凋亡蛋白(Bax,Bak,Cytochrome C)内源性凋亡途径被激活,线粒体自噬也在scAAV9-hIGF-1处理后被激活。我们证明了线粒体电跨膜电位增加和异常线粒体的转化。

选取TDP-25稳转细胞系作为细胞模型,在细胞培养液中给予不同浓度scAAV9-hIGF-1干预,利用细胞活力检测试剂盒CCK8测定不同浓度的细胞活力;利用酶联免疫吸附试验ELISA检测细胞及培养液中hIGF-1的含量;进一步采用蛋白免疫印迹方法测定scAAV9-hIGF-1及AAV9-GFP作用不同时间点的GFP及VDAC的表达,从而选取作用的浓度及时间。

采用该浓度及时间进行下一步试验。试验组细胞培养液中给予scAAV9-hIGF-1,对照组细胞培养液中给予AAV9-GFP,应用透射电镜观察细胞中线粒体的形态学变化;采用流式细胞学分析线粒体膜电位变化;新鲜取材提取细胞线粒体及胞浆蛋白,经过蛋白免疫印迹方法分析Bcl2、Bcl-xl、Bax、Bak、Cytochrome C、LC3、P62的蛋白含量变化。

参考文献

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