人肺癌标志物DR-70(DR-70TM)Elisa试剂盒的应用

背景^[1-3]

人肺癌标志物DR-70(DR-70TM)Elisa试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）。在预包被抗人肺癌标志物DR-70（DR-70TM）抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入人肺癌标志物DR-70（DR-70TM）校准品和待测样本，再加入另一株HRP标记的抗人肺癌标志物DR-70（DR-70TM）抗体（酶标抗体），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体-抗原-酶标抗体的夹心复合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M硫酸）作用下，最终转化为黄色，在酶标仪450nm波长上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中人肺癌标志物DR-70（DR-70TM）的浓度正相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中人肺癌标志物DR-70（DR-70TM）的浓度。

人肺癌标志物DR-70(DR-70TM)Elisa试剂盒

人肺癌标志物DR-70(DR-70TM)Elisa试剂盒样本处理及要求：

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

7.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

人肺癌标志物DR-70(DR-70TM)Elisa试剂盒操作程序：

所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。

1、按前面说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。

2、从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。

3、设置标准品孔、0值孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，0值孔加样本稀释液50μL，空白孔不加，样本孔加待测样本50μL。

4、除空白孔外，标准品孔、0值孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶（HRP）标

记的检测抗体100μL。

5、用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光孵育60min。

6、揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置20S，甩

去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复5次。若使用自动洗板机，请按洗板机操

作程序进行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加

底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。

7、将底物A和B按1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用

封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光孵育15min。

8、所有孔加入终止液50μL，在酶标仪450nm波长上读取各孔吸光度（OD值）。

应用^[4][5]

人肺癌标志物DR-70(DR-70TM)Elisa试剂盒可以用于影像学与检测血清肿瘤标志物诊断早期肺癌的实验研究

探讨经气管插管由同轴微导管超选择精确定位,灌注不同剂量的甲基胆蒽(methylcholanthrene,MCA)、二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)及超液化碘油混悬液,诱导犬肺癌模型,为肺癌深入研究建立新的平台。通过影像学的胸部X线平片、计算机螺旋断层扫描摄像术(spiral computed tomography,螺旋CT)、数字减影血管造影(digital substraction angiography,DSA)检查、血.清肿瘤标志物(tumor maker,TM)检测及病理检查,探讨肺癌发生发展过程中早期的影像学表现,血清肿瘤标志物的改变及病理学表现,从分子生物影像学提出早期肺癌诊断的新标准,使肺癌综合治疗的临床效果产生一个新飞跃。

材料与方法选用30只犬龄1-3岁,体重15-20Kg的杂种犬为研究对象,雌雄均有。实验前均行疫苗接种,观察数日确定犬仍处于健康状态后随机将30只犬分为A(8只)、B(8只)、C(7只)、D(7只)四组。饲养数日观察实验犬正常,经犬前腿取静脉血3m1,室温下保存0.5-1h,离心取上层血清,进行肿瘤标志物的检测。将犬进行全身麻醉,采用改良式气管插管出同轴微导管精确定位向右肺隔叶灌注致癌药物：A、C组灌注甲基胆葸(MCA)0.25g+二乙基亚硝胺(DEN)0.38g+超液化碘油混悬3m1；B、D组灌注甲基胆葸(MCA)0.35g+二乙基亚硝胺(DEN)0.48g+超液化碘油混悬3m1。分别在第6、12个月对四组实验犬再次进行血清TM检测。同时分别行X线胸片、CT、DSA检查。C、D组实验犬在饲养12月做完上述检查后处死,取注药部位肺组织,加10%中性福尔马林液固定,石蜡包埋(切片厚度5μm)HE染色,根据标本染色情况,选取结构完整标本进行后续染色观察及统计处理。使用包括人肺癌标志物DR-70(DR-70TM)Elisa试剂盒等检测四组实验犬不同时期CA125、Cyfra21-1、CEA、SCC-Ag、Cal 53、DR70、NSE 7种血清TM,对所得数据进行统计处理,观察TM指标是否随时间的推移增高。

参考文献

[1]Pathology and Pathogenesis of Ovine Pulmonary Adenocarcinoma[J].D.J.Griffiths;;H.M.Martineau;;C.Cousens.Journal of Comparative Pathology,2010(4)

[2]Increased Serum CA-125 Levels in Patients with Lung Cancer Post Thoracotomy[J]..Southern Medical Journal,2009(4)

[3]CYFRA 21-1 in Non-Small Cell Lung Cancer–Standardisation and Application during Diagnosis[J].Radomir Pavičević;;Gordana Bubanović;;Ana Franjević;;Dinko Stančić-Rokotov;;Miroslav Samardžija.Collegium Antropologicum.2008

[4]Squamous Cell Carcinoma Antigen in Lung Cancer and Nonmalignant Respiratory Diseases[J].Katsunori Kagohashi;;Hiroaki Satoh;;Koichi Kurishima;;Kennosuke Kadono;;Hiroichi Ishikawa;;Morio Ohtsuka;;Kiyohisa Sekizawa.Lung,2008(5)

[5]聂春晖.影像学与检测血清肿瘤标志物诊断早期肺癌的实验研究[D].天津医科大学,2011.