TRPV5抗体的应用

背景^[1-3]

TRPV5抗体是一种IgG2aκ小鼠单克隆TRPV5抗体（也称为TRPV5抗体），它通过WB、IP、IF和ELISA检测小鼠、大鼠和人类来源的TRPV5蛋白。TRPV5抗体（B-8）既以非偶联抗TRPV5抗体形式提供，也以多种偶联形式的抗TRPV5抗体提供，包括琼脂糖、HRP、PE、FITC和多种Alexa Fluor®偶联物。瞬时受体电位（TRP）蛋白是阳离子敏感通道，可调节多种细胞功能，包括温度感觉和血管调节。从VR-1旁基因转录而来的热敏感、辣椒素不敏感的TRPV3在温暖温度下表达；其表达量会随着有害温度的增加而增加。人类TRPV3在皮肤、舌头、背根神经节、三叉神经节、脊髓和大脑中表达。此外，TRPV3与VR-1在背根神经节神经元中共表达。TRPV3与VR-1相关联，并可能调节VR-1的活性。由729个氨基酸组成的TRPV5（ECAC1）蛋白包含六个跨膜结构域、多个潜在磷酸化位点、一个N-连接糖基化位点和三个锚蛋白重复区域。它在肾脏、空肠和胰腺中大量表达，在睾丸、前列腺、胎盘、大脑、结肠和直肠中的表达水平较低。TRPV5控制肾脏和肠道中维生素D3调节的Ca2+重吸收的限速步骤；TRPV5的5′-侧翼区域包含四个推定的维生素D3反应元件。

TRPV5抗体

TRPV5抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（TRPV5抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(TRPV5抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

TRPV5抗体可以用于TRPV5在头孢曲松结石大鼠模型肾脏中的表达及意义

通过构建头孢曲松钠结石大鼠模型,探讨钙离子通道蛋白TRPV5在头孢曲松钠结石模型组大鼠和正常对照组大鼠的表达差异,其表达的量与头孢曲松钠干预时间的相关性,为研究头孢曲松钠相关肾结石的发生机制提供新的理论依据。

方法:将30只雄性SD大鼠随机分为3组,编为A、B、C三组,其中A组给予120mg/kg/d蒸馏水灌胃4周,B组、C组给予头孢曲松钠溶液120mg/kg/d分别灌胃2周和4周;试剂盒检测各组血、尿生化指标;相差显微镜下观察A、B、C三组肾脏组织病理切片中结晶形成情况;采用TRPV5抗体免疫组织化学染色法检测大鼠肾组织TRPV5的定性表达;采用TRPV5抗体双抗体夹心法定量各组大鼠肾组织中TRPV5表达水平。

TRPV5抗体结果:三组血钙浓度无统计学差异(P>0.05),C组与A组比较血肌酐明显升高[(96.29±21.81)umol/L vs(34.72±10.49)umol/L,P<0.05],C组与B组比较血肌酐升高[(96.29±21.81)umol/L vs(59.98±20.45)umol/L,P<0.05];C组尿钙浓度相比较A组明显升高[(0.72±0.25)mmol/L vs(0.46±0.23)mmol/L,P<0.01],C组与A组比较尿肌酐降低[(2488.28±435.75)umol/L vs(3463.57±221.76)umol/L,P<0.01]。C组中TRPV5蛋白在肾脏中表达明显低于A组、B组[(217.79±48.31)ng/L vs(395.66±74.69)ng/L、(343.08±74.08)ng/L,P<0.01],TRPV5在三组血清中的表达无明显差异(P>0.05)。

参考文献

[1]A Single Nucleotide Polymorphism(rs4236480)in TRPV5 Calcium Channel Gene Is Associated with Stone Multiplicity in Calcium Nephrolithiasis Patients[J].Anas Khaleel;;Mei-Shin Wu;;Henry Sung-Ching Wong;;Yu-Wen Hsu;;Yii-Her Chou;;Hsiang-Yin Chen;;Grace Kuo.Mediators of Inflammation,2015

[2]Possible Function of Urinary pH and Citrate on the Ceftriaxone-induced Nephrolithiasis[J].Xiaoming Cong;;Xiaojian Gu;;Xizhao Sun;;Benxiang Ning;;Luming Shen.Urology.2014

[3]Increased urinary calcium excretion caused by ceftriaxone:possible association with urolithiasis[J].Takahisa Kimata;;Kazunari Kaneko;;Masaya Takahashi;;Masato Hirabayashi;;Tomohiko Shimo;;Minoru Kino.Pediatric Nephrology,2012(4)

[4]Ceftriaxone crystallization and its potential role in kidney stone formation[J].Somchai Chutipongtanate;;Visith Thongboonkerd.Biochemical and Biophysical Research Communications,2011(3)

[5]孙允冀.TRPV5在头孢曲松结石大鼠模型肾脏中的表达及意义[D].兰州大学,2016.