Western blot检测服务

背景^[1-6]

Western blot检测服务主要是利用电泳技术（SDS-PAGE）区分不同大小的蛋白，然后转移至固相支持物（PVDF膜，NC膜等）上，再根据抗原抗体的特异性结合原理，通过化学发光或呈色等技术检测蛋白的表达。Western Blot采用的是变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质混合物，经过SDS-PAGE分离的蛋白质被到转移到固相支撑物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持膜上蛋白质或多肽的抗原性质不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与其对应的抗体发生免疫反应，一抗再与酶标记的二抗体起反应，经过底物显色以检测特异蛋白质表达水平。

Western Blot实验流程

1、蛋白质抽提

A、实验对象为组织样品，取适量（250-500mg）新鲜组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白。

B、实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白。

2、蛋白质定量

按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。

3、变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)

将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进个孔中，电泳分离蛋白。

4、蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜

5、膜的封闭和抗体孵育

A、膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。

B、封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。

C、加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。

6、结果检测

化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。

7、数据分析

目的蛋白的灰度值除以内参GAPDF的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。

8、提供实验报告

包括详细的实验方法及Western Blot实验结果。

应用^[7][8]

Western blot检测服务可用于研究蛋白信号通路与癌症侵袭转移关系：

卵巢癌是世界范围内最致命的妇科恶性疾病之一,由于缺乏典型的临床症状、特异的体征及肿瘤标志物等有效的筛查手段,绝大多数卵巢癌病人在得到诊断时已处于晚期,使其死亡率高居妇科恶性肿瘤首位。肿瘤的转移能力有赖于细胞的迁移与侵袭,然而决定肿瘤转移能力的分子机制目前仍然不十分清楚。因此,努力探索调控卵巢癌细胞转移潜能的分子靶标将至关重要。

Hedgehog(Hh)信号通路在细胞命运决定以及细胞增殖过程中发挥重要作用。该通路由Hh配体,膜受体Ptch和跨膜信号转导蛋白Smo以及参与Hh信号转导的胞浆蛋白复合体组成,其级联传导的末点被公认为锌指转录因子Gli(Glioma-associated oncogene transcription factors),是该信号通路的关键节点,在信号转导中起枢纽作用。Hh靶基因涉及细胞增殖、细胞存活、细胞分化、细胞周期以及干细胞形成和细胞侵袭等多方面。通过Western-blot及real-time PCR等方法检测卵巢癌及正常卵巢组织中Hh信号通路重要组分蛋白Shh、Gli1、Gli2等的蛋白水平及mRNA水平的表达情况。

采用real-time PCR和Western blot在mRNA以及蛋白水平验证芯片结果,发现经GANT61处理的SKO-V3细胞,ITGB4,COL1A1,COL5A1等基因mRNA水平表达明显下降,(p<0.01)；而LAMC2,ITGA5,LAMA3等基因mRNA水平表达明显升高,(p<0.01),与Microarray所获结果一致。此外,CD24,CD70,S100A2及MMP7等mRNA表达水平下降,(p<0.01);而S100A4和FAK mRNA水平无显著差异,(p>0.05),与Microarray所获结果基本一致；Western blot结果显示：GANT61处理的SKO-V3细胞,ITGB4,CD24,MMP7等蛋白表达水平明显下降,(p<0.01)；而FAK蛋白表达水平改变不明显,(p>0.05),与real-time PCR结果基本一致。采用Shh配体条件培养液(Shh-Med)激活Hh信号通路,观察上述差异基因的表达变化

参考文献

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[8]陈琦.Hedgehog信号通路与卵巢癌侵袭转移关系的实验研究[D].南昌大学,2013.