GRP75抗体的应用

背景^[1-3]

GRP75抗体也被称为葡萄糖调节蛋白75抗体或Mortalin抗体，是针对GRP75（或Mortalin）蛋白的一种特异性抗体。GRP75是HSP70家族的一员，是一种非热诱导的伴侣蛋白，主要存在于线粒体基质中，参与新生多肽链的转运和折叠。以下是对GRP75抗体的详细介绍：

GRP75抗体

一、基本信息

英文名：Grp75 Antibody，也称为Mortalin Antibody

别名：包括HSPA9B、MOT2、mthsp75、MORTALIN 2、MOT、mortalin-2、PBP74、HSP A9、HSP-A9等

预测分子量：75kDa

二、功能与应用

功能：GRP75在细胞内具有多种功能，包括参与蛋白质折叠、与HSP60协同作用、灭活肿瘤抑制因子p53等。此外，GRP75在多种肿瘤组织和永生化细胞系中高表达，提示其在肿瘤形成中可能发挥重要作用。

应用：GRP75抗体广泛应用于科学研究领域，包括Western Blot（WB）、免疫组织化学（IHC）、免疫细胞化学（ICC/IF）、免疫沉淀（IP）和酶联免疫吸附测定（ELISA）等实验。

三、保存条件与注意事项

保存条件：GRP75抗体一般建议保存在-20℃以下，避免反复冻融以保持其活性和稳定性。

注意事项：在使用抗体前，应仔细阅读产品说明书，了解抗体的稀释比例、使用方法和注意事项。同时，注意保持实验环境的清洁和无菌操作，避免抗体受到污染。

GRP75抗体使用步骤会根据实验类型（如Western Blot、免疫组织化学、ELISA等）而有所不同。

使用GRP75抗体的Western Blot步骤：

1.样品准备：

提取目标蛋白。

通过SDS-PAGE电泳分离蛋白质。

将蛋白质转移到合适的膜上，如PVDF或硝酸纤维素膜。

2.封闭：

用含有5%脱脂奶粉或BSA的TBST缓冲液封闭膜，以减少非特异性结合。

抗体孵育：

用TBST缓冲液稀释GRP75抗体（例如1:1000稀释比例）。

将膜与稀释后的抗体在室温下孵育1-2小时，或在4°C下过夜。

3.洗涤：

使用TBST缓冲液洗涤膜，每次5-10分钟，重复3-5次。

4.检测：

使用相应的二抗（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗兔或抗山羊IgG）进行孵育。

再次洗涤膜。

使用化学发光或显色底物进行信号检测。

应用^[4][5]

GRP75抗体可以用于GRP75在戊型肝炎病毒感染过程中的作用机制研究

筛选出一株可高效支持不同基因型HEV体外增殖的细胞系,为HEV的研究提供材料支撑;其次利用能够模拟HEV病毒粒子结构的衣壳蛋白截短片段（aa 368～660,文中后续简称K239蛋白,来源于人兽共患HEV-3 Kernow C1/p6毒株）为诱饵蛋白,通过质谱技术筛选到HEV易感细胞系中与K239蛋白互作的宿主蛋白GRP75,并进一步证实了GRP75蛋白与HEV衣壳蛋白ORF2的相互作用,发现GRP75蛋白可作为拮抗HEV复制的抗病毒宿主因子发挥作用。

其主要研究内容如下:一、HEV体外高效增殖细胞系的筛选与鉴定制备了HEV-ORF2特异性的多克隆抗体用于HEV增殖的检测。将HEV-1 Sar55毒株（Sar55）感染性克隆通过体外转录的方式获得病毒RNA（传染性核酸）,转染8种肝癌来源的细胞（3B-P2,97h,LD2,CM3,Huh7,7721,Hep G2/C3A,S10-3）。通过自行制备的HEV-ORF2兔多克隆抗体进行免疫荧光（Immunofluorescence,IFA）检测,发现S10-3细胞对Sar55毒株增殖的支持程度最高。再对S10-3细胞进一步亚克隆后,成功筛选到一株能支持HEV-1感染的阳性亚克隆,将其命名为S10-3C12-C5细胞。进一步确认HEV-3 Kernow C1/p6毒株（Kernow C1/p6）在该细胞系中也可进行高效复制,同时对HEV-1和HEV-3在S10-3C12-C5细胞系中的复制效率进行比较,为后续研究奠定材料基础。分析了HEV-1和HEV-3在该易感细胞系中的转录组数据,试图探究不同基因型HEV对宿主细胞的易感性与宿主细胞差异基因表达的关系。

二、HEV-ORF2互作宿主蛋白的筛选与鉴定利用HEV-3型衣壳截短片段K239蛋白作为诱饵蛋白,与CNBr-activated SepharoseTM 4B琼脂糖填料偶联后,与HEV易感细胞S10-3C12-C5膜蛋白进行孵育,收集样品进行银染分析,观察到两条明显的特异性条带;切胶进行蛋白质谱分析后,综合三次蛋白质谱结果,确定GRP75蛋白作为研究对象;利用GRP75抗体免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）和IFA等方法,进一步验证了GRP75与HEV-3衣壳蛋白的相互作用,并确定GRP75的底物结合结构域（Substrate binding domain,SB）可直接与HEV衣壳蛋白作用。

三、GRP75蛋白调控HEV感染机制的研究为探究GRP75蛋白与HEV感染之间的相互关系,我们利用GRP75抗体蛋白免疫印迹（Western blot）和实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,q RT-PCR）证实,在肝癌细胞系S10-3C12-C5中敲低GRP75可以显著增加HEV的感染水平,而过表达GRP75则会抑制HEV的复制。继续研究发现GRP75对HEV及病毒衣壳蛋白的吸附过程无影响,但是可以正向调控HEV和病毒衣壳蛋白的内化过程。但GRP75蛋白可以通过溶酶体途径影响HEV-ORF2蛋白的稳定性。我们通过对ORF2蛋白的氨基酸序列进行分析后,发现其含有分子伴侣介导自噬（Chaperone-mediated autophagy,CMA）通路所必须的KFERQ样基序,即CMA基序。通过对HEV-ORF2蛋白CMA样基序突变之后,GRP75蛋白对ORF2的降解作用被抑制,而且ORF2可以与CMA通路中溶酶体相关膜蛋白2A（Lysosome membrane-associated protein type 2A,LAMP2A）发生相互作用。说明了尽管在病毒吸附阶段,GRP75可能促进病毒的内化,但在病毒复制的过程中,GRP75蛋白可以通过分子伴侣介导的自噬通路促进HEV-ORF2蛋白的降解,从而抑制HEV感染。

参考文献

[1]Abrogating the Interaction Between p53 and Mortalin(Grp75/HSPA9/mtHsp70)for Cancer Therapy:The Story so far[J].Elwakeel Ahmed.Frontiers in Cell and Developmental Biology,2022

[2]Avian Hepatitis E Virus ORF2 Protein Interacts with Rap1b to Induce Cytoskeleton Rearrangement That Facilitates Virus Internalization.[J].Zhang Beibei;Fan Mengnan;Fan Jie;Luo Yuhang;Wang Jie;Wang Yajing;Liu Baoyuan;Sun Yani;Zhao Qin;Hiscox Julian A;Nan Yuchen;Zhou EnMin.Microbiology spectrum,2022

[3]Tumor Susceptibility Gene 101(TSG101)Contributes to Virion Formation of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus via Interaction with the Nucleocapsid(N)Protein along with the Early Secretory Pathway.[J].Zhang Longxiang;Li Rui;Geng Rui;Wang Lei;Chen XinXin;Qiao Songlin;Zhang Gaiping.Journal of virology,2022

[4]Cell Division Control Protein 42 Interacts With Hepatitis E Virus Capsid Protein and Participates in Hepatitis E Virus Infection[J].Fan Mengnan;Luo Yuhang;Zhang Beibei;Wang Jiaxi;Chen Tianxiang;Liu Baoyuan;Sun Yani;Nan Yuchen;Hiscox Julian A.;Zhao Qin;Zhou En Min.Frontiers in Microbiology,2021

[5]李亚菲.GRP75在戊型肝炎病毒感染过程中的作用机制研究[D].西北农林科技大学,2023.