细胞划痕实验服务

背景^[1-7]

细胞划痕实验服务是研究细胞迁移能力的体外试验服务。其原理是，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，即为“划痕”，划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。通过对不同时期划痕区域细胞状态的观察，对细胞的迁移能力进行判断。创伤愈合实验是一种简单、廉价的方法，也是最早发展起来的研究定向细胞在体外迁移的方法之一。该方法模拟了细胞在体内愈合过程中的迁移过程。

基本步骤包括在细胞单层中创建一个“伤口”，在细胞迁移过程中在开始和定期捕获图像以关闭伤口，以及比较图像以确定细胞迁移速率。细胞迁移是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。免疫反应、炎症反应、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。

实验步骤：

1.培养板接种细胞之前先用marker笔在12孔板背面画横线标记（方便拍照时定位同一个视野）。

2.细胞消化后接入12孔板，数量以贴壁后铺满板底为宜（数量少时可培养一段时间至铺满板底）。

3.细胞铺满板底后，用1 ml枪头垂直于孔板制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。（人工枪头制造划痕难以保证划痕宽度的一致性，影响实验结果，这也是该方法的缺陷。）

4.吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞碎片。

5.加入无血清培养基，拍照记录。

6.将培养板放入培养箱培养，每隔4-6小时取出拍照。

7.根据收集图片数据分析实验结果。

特点：

1.在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。

2.非常适合研究细胞与胞外基质（ECM），细胞与细胞之间相互作用引起的细胞迁移。

3.与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析细胞间的相互作用

4. 研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。

注意事项

1.划痕法测量适用的细胞范围较小，一般只适用于上皮细胞，纤维样细胞。

2.虽然无血清培养可以忽略细胞增殖的影响，但是由于细胞内信号传导系统整体性的下调节，细胞迁移的速度也会慢很多。

应用^[8][9]

细胞划痕实验服务可用于人表皮细胞，人成纤维细胞增殖和迁移在创伤愈合中的作用及机制研究：

研究以皮肤创伤愈合相关细胞：人表皮HaCaT细胞株、人成纤维细胞株为研究对象，考察富组蛋白1（Histatin1，Hst1）对两者增殖和迁移功能的影响，并初步探讨其作用机制，旨在探明唾液特有抗菌肽Hst1对非口腔黏膜细胞的有无影响，能否促进皮肤创伤愈合，为促进皮肤创面愈合提供新的治疗思路。研究方法人表皮HaCaT细胞株、人成纤维细胞株按常规方法培养，取对数生长期细胞进行下述实验。

采用细胞计数法、MTT比色法考察不同浓度（3～100μg/mL）Hst1于不同时相点（24h、48h、72h）对人表皮HaCaT细胞株、人成纤维细胞株增殖功能的影响，并对其与人重组表皮生长因子（rhEGF）的相互作用关系进行比较。通过流式细胞术检测不同作用时相点不同浓度Hst1对两种细胞周期的影响，初步探讨其促增殖机制。

利用体外细胞划痕实验，考察不同时相点，丝裂霉素C（MMC）处理后或未处理时Hst1和（或）rhEGF对人表皮HaCaT细胞株、人成纤维细胞株划痕创伤愈合率的影响。近来研究发现唾液中的抗菌肽成分——富组蛋白能够促进口腔黏膜上皮细胞迁移，是口腔黏膜创伤愈合的主要影响因子。抗菌肽属天然免疫防御系统成员，目前研究发现其某些成员具有抵抗病原微生物以及促创伤愈合的双重功能，是一类极具应用前景的新型创伤治疗药物。

参考文献

[1]Effect of growth factors on the migration of equine oral and limb fibroblasts using an in vitro scratch assay[J].Michael T.Rose.The Veterinary Journal.2012(2)

[2]Wound healing activity of the human antimicrobial peptide LL37[J].Peptides.2011(7)

[3]EGFR and IL-1 Signaling Synergistically Promote Keratinocyte Antimicrobial Defenses in a Differentiation-Dependent Manner[J].Andrew Johnston,Johann E.Gudjonsson,Abhishek Aphale,Andrew M.Guzman,Stefan W.Stoll,James T.Elder.Journal of Investigative Dermatology.2011(2)

[4]Licking as an out-of-hospital burns treatment—An isolated cultural phenomenon?[J].Deirdre M.Seoighe,Joseph F.Baker,Frank Conroy.Burns.2010(2)

[5]Histatins Enhance Wound Closure with Oral and Non-oral Cells[J].Oudhoff,MJ,van den Keijbus,PAM,Kroeze,KL,Nazmi,K,Gibbs,S,Bolscher,JGM,Veerman,ECI.Journal of Dental Research.2009(9)

[6]Peptide antibiotics:An alternative and effective antimicrobial strategy to circumvent fungal infections[J].K.Ajesh,K.Sreejith.Peptides.2009(5)

[7]Chronic Wound Infection and Antimicrobial Use[J].Stephan J.Landis.Advances in Skin&Wound Care.2008(11)

[8]Fibroblast migration and collagen deposition during dermal wound healing:mathematical modelling and clinical implications[J].McDougall Steven,Dallon John,Sherratt Jonathan,Maini Philip.Philosophical Transactions of The Royal Society A.2006(1843)

[9]蒋艳.富组蛋白1促进人表皮细胞，人成纤维细胞增殖和迁移在创伤愈合中的作用及机制研究[D].第三军医大学,2012.