小鼠肺动脉平滑肌细胞的培养

发布日期:2020/2/17 7:46:49

背景及概述^[1-2]

平滑肌细胞又叫平滑肌纤维，系构成平滑肌的纤维状长细胞。由于平滑肌所分布的部位不同，平滑肌细胞的长度很不一致，在小血管壁上的平滑肌细胞长度仅有20μm左右，妊娠期子宫壁平滑肌细胞可长达500μm，位于一般器官平滑肌细胞的长度约200μm左右，此细胞的宽度在7μm以内。肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的结构和功能对维持肺循环低阻高排的正常生理功能，在调控肺血管的收缩和舒张功能中有重要作用。PASMCs的异常是肺动脉高压(PAH)发生发展的重要病理学特征，其凋亡和增殖失衡是肺血管重塑的关键。近年来，国内外广泛开展大鼠PASMCs的原代培养方法，在细胞学水平观察PASMCs的增殖和凋亡来探讨慢性PAH的发病机制。尽管目前小鼠作为基因敲除及转基因动物模型，已经用于人类PAH疾病模型的病理及治疗领域的基础研究，但是为进一步从细胞学和分子水平阐明肺动脉高压发病机制及治疗药物筛选的研究，仍然需要建立小鼠肺动脉平滑肌细胞原代培养细胞模型，以满足于体外实验的研究。

培养^[2]

1）取材

实验前12h禁食，自由进水，小鼠颈椎脱臼致死，置于体积分数为75%的消毒乙醇浸泡2min，无菌操作下迅速分离出心肺组织，置于盛有含有1%青链霉

0.01mol/LPBS培养皿中。转移至无菌操作台中，漂洗心肺组织数次，在解剖显微镜直视下仔细剥离出肺动脉主干和左右肺动脉干，将动脉外膜纤维结缔组织剥离干净，分离出的肺动脉用含1%青链霉素的0.01mol/LPBS的培养皿中冲洗数次，以避免血细胞等的混杂。眼科剪纵向剪开肺动脉，内膜面朝上，用刀片来回轻刮

2～3遍，去除内膜，尽量将内膜内皮细胞除尽。将中膜转移至盛有含10%胎牛血清的DMEM/F12的培养基中，用眼科剪反复剪成碎小组织块，备用。

2）酶消化培养法培养小鼠肺动脉平滑肌细胞

实验前配制酶联合消化液二硫苏糖醇DTT：0.14mg，牛血清白蛋白：2mg，Ⅰ型胶原酶：8.53mg，木瓜蛋白酶：0.2mg溶于1mLD-Hank’s平衡盐缓冲液。联合酶消化组织法将动脉撕成小碎块，放入15ml离心管中，再加入酶联合消化液，为组织块体积的5～10倍。置于37℃水浴摇床，90r/min消化，每15～20min观察一次并轻轻摇动，消化时间大约需40min，待动脉碎块消化成絮状物时，用1000r/min离心7min，弃去上清液。加入3ml含有10%FBSDMEM/F12培养液，充分吹打混匀后于25cm2培养瓶，置37℃、5%CO2的孵育箱中培养。PASMCs酶消化培养法酶联合消化法分离的细胞，于24h后贴壁呈分散状不规则型生长(a)，3d开始细胞生长旺盛，胞质伸展，呈三角形、长梭形、不规则型可见多数核分裂像聚集成团生长(b)；第4～d天细胞快速生长，衔接紧密，呈单层片状排列(c)；第7d即可传代，镜下透明度及折光性强。

3）组织贴块培养法培养小鼠肺动脉平滑肌细胞

待10h后，大量单个平滑细胞已经贴壁，轻轻收集未贴壁的组织块絮状物重悬于新的25T培养瓶中，在已经贴壁生长的平滑肌细胞培养瓶中加入新配制的10%FBSDMEM/F12培养液，均置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养，3d后在显微镜下观察。PASMCs原代培养成活的组织块收缩、变圆，成活率达60%～80%，于接种后第3～4d即有细胞从组织块周围长出，呈放射状排列(图2a)，细胞形态呈不规则形。第8～10d后，细胞进入对数生长期，可见多数核分裂像，组织块周边细胞数量增多(图2b)。第11～15d后组织块间的细胞相互融合，呈长梭形、螺旋形紧密排列。

4）ASMCs传代及纯化培养

待细胞生长至70%～80%时，弃去旧培养基，用0.01mol/LPBS液清洗2次，加质量浓度为2.5g/L胰蛋白酶消化液，室温下消化约2min，加入含体积分10% FBSDMEM/F12培养基终止消化，用吸管轻轻地将细胞吹打下来，离心、去上清、重悬细胞。取消化传代细胞混悬液18μl，加入2μl体积分数0.4%台盼蓝溶液，混匀后吸取10μl于计数板上，置光学显微镜下观察并行计数后传代培养，每隔1d换液一次，待细胞融合成致密单层后可再次传代。2种方法培养的细胞长至70%～80%即可传代，2.5g/L胰蛋白酶消化后，细胞呈单个，亮而圆，1d后，细胞贴壁，呈散在的长梭形，3～5d后细胞呈“峰-谷”状生长，“峰”处细胞互相重叠，“谷”处细胞仅1层-2层，甚至无细胞，融合率达80%左右。细胞体外培养时，从细胞开始生长3～5d可传代1次。PASMCs计数97%的细胞未着色，即细胞的成活率为97%，表明培养的细胞传代成活率高(图3a、3b)。

4）小鼠肺动脉平滑肌细胞的荧光鉴定

分别取生长状态良好的P2代细胞，以每孔2×105个细胞接种于内置有盖玻片的6孔板中培养，24h后待细胞自然贴壁、生长良好时，弃去培养基，取出盖片，PBS冲洗3次，每次3min；40g/L多聚甲醛固定30min，PBS冲洗3次，每次3min；3g/L聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X-100)孵育20min，PBS冲洗3次，每次3min；FBS室温封闭30min，弃去，分别加兔抗小鼠a-平滑肌肌动蛋白(a-smoothmuscleactin，a-SMA)抗体250μl(稀释度为1∶100)4℃过夜，PBS冲洗3次，每次3min；对应加入FITC标记及TRITC标记山羊抗兔(二抗)250μl(稀释度为1∶200)室温1h，PBS冲洗3次，每次3min；DAPI10min避光复染核，荧光显微镜下观察；同时做山羊抗小鼠vimentin荧光对照实验，余步骤同前。细胞行a-SMA特异性免疫荧光鉴定，结果可见胞质着色，胞核清晰可见，培养的PASMCs阳性率均达98%以上(图4a、b)；行vimentin表达阴性；所得细胞确为典型的PASMCs且纯度高。