二苯并环辛炔-N-羟基琥珀酰亚氨基基酯的有关研究

概述

二苯并环辛炔-N-羟基琥珀酰亚氨基基酯又名二苯环辛炔-活性酯，英文名称DBCO-NHS Ester，其分子式为C₂₃H₁₈N₂O₅，分子量为402.4，常表现为白色固体。二苯并环辛炔-N-羟基琥珀酰亚氨基基酯是一种常用的胺反应化学试剂，可用于修饰有机溶剂中的含胺分子（在水介质中的溶解度有限）。它与初级胺（如赖氨酸残基侧链或氨基硅烷涂层表面）在中性或稍碱性pH下反应，形成共价键。此外，作为二苄基环辛炔的衍生物，它还可用于无铜点击化学反应，例如无铜叠氮化物-炔烃环加成反应。

有关研究

抗体-DNA结合反应的点击化学是一种非常安全的反应，具有高化学选择性，易于操作，多功能，高产率的优点。因为二苯并环辛炔和叠氮化物都不存在于生物系统中，因此与其他化学相比，点击化学为生物分析提供了更高的准确性。另一方面，无铜点击反应条件非常适合生物分子，并且可以用一般的实验室技能容易进行这种偶联，具有反应优势。非常特异的烷基和叠氮化物反应在抗体DNA之间产生高度稳定的三唑键，与其他化学物质相比，这种点击共轭共轭探针在4℃下长时间储存非常稳定。关于该化学方法的具体方案如下：用溶解在DMSO中的20倍摩尔过量4mM交联剂二苄基环辛烯NHS酯（CLK-A102N，二苯并环辛炔-N-羟基琥珀酰亚氨基基酯）激活PBS中的抗体，在室温下孵育30分钟。通过加入1M Tris-HCl，pH 8.0停止反应。在RT下孵育5分钟。用平衡的Zeba Spin脱盐柱（7k MWCO，Thermo Scientific）从活化的抗体中去除过量的二苯并环辛炔-N-羟基琥珀酰亚氨基基酯。纯化后，将二苯并环辛炔标记的抗体与4倍摩尔过量的叠氮化物修饰的寡核苷酸混合，并在4°C下孵育过夜，即可完成反应[1]。

除了上述的DNA辅助分析，二苯并环辛炔-N-羟基琥珀酰亚氨基基酯在细胞内成像方面也有一定的应用。百分之九十的癌症致死病例由癌转移和肿瘤复发造成，癌症干细胞(Cancer Stem Cells, CSCs)的存在是其关键因素，现有的治疗手段无法有效杀死CSCs。因此癌症干细胞的识别和分离成为发展癌症早期诊断和治疗新方法的关键。从癌症干细胞与普通癌细胞的表型差异出发，包括癌症干细胞比普通癌细胞代谢速度慢、细胞内还原性可能更强(H₂S浓度相对较高)，发展了新的细胞代谢标记荧光成像检测和细胞内源性H₂S检测方法，为准确识别癌症干细胞提供了有力的支持。研究主要包括具体工作：基于叠氮-炔基1,3-偶极环加成反应的比率型荧光成像方法，首次提出了比率型荧光点击化学反应，实现了活细胞中的代谢标记点击化学标签的比率型成像检测。点击化学联合代谢标记广泛地应用于细胞中生物大分子的成像分析。目前所报道的此类荧光成像技术均基于单一荧光强度来实现，而荧光强度会受到荧光团浓度、所处的微环境、激发光强度的影响，这些因素在进行荧光成像时难以控制。比率型荧光成像可以大大减少上述因素对荧光成像的干扰。本论文首次实现了活细胞中的基于叠氮-炔基环加成反应的比率型荧光成像。比率型荧光探针是在甲酚紫(Cresyl Violet, CV)分子上修饰得到的,甲酚紫的荧光发射峰在620nm，当甲酚紫上的氨基被叠氮基团取代之后得到叠氮甲酚紫(Azido Cresyl Violet, Acv)，由于叠氮基团的氮元素上富含电子，促使该分子的发射峰发生蓝移到566nm。当叠氮化合物与炔基化合物发生点击化学反应时会生成三唑类化合物，该化合物与Acv相比，具有较低的电子云密度，从而使荧光发射峰重新出现在620nm，而566nm处的荧光信号降低。随着反应的继续进行，620nm处的荧光信号逐渐增强,566nm处的荧光信号逐渐降低，同时两者的信号比(I620nm/I66nm)也会随之发生相应的变化。用炔基化合物炔基胆碱(Propargyl Choline, PCho)和环辛炔衍生物(dibenzocyclooctyne-PEG4-N-hydroxysuccinimidyl ester，二苯并环辛炔-N-羟基琥珀酰亚氨基基酯)对细胞进行标记，Acv与炔基发生点击化学反应从而标记在细胞上，从而实现了比率型荧光成像。相对于基于单一发射波长的荧光探针的细胞成像而言，比率型成像能够在很大程度上降低背景干扰。由于生物体中几乎所有的生物大分子都可以进行代谢标记，所以该方法可有望用于各种类型的生物大分子的成像研究[2]。

参考文献

[1] Al-Amin A .DBCO-NHS ester cross linker assisted click chemistry reaction for antibody-DNA conjugation protocol[J].  2016.DOI:10.13140/RG.2.1.2819.4328.

[2]付红霞.基于点击化学反应的比率型细胞成像和银放大技术的内源性H_2S气体检测新方法[D].陕西师范大学,2016.