人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)Elisa试剂盒的应用

背景^[1-3]

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)Elisa试剂盒是用于检测生物样本中GM-CSF含量的试剂盒。人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)Elisa试剂盒基于双抗体夹心ELISA法原理，利用特异性抗人GM-CSF单克隆抗体包被于酶标板上，通过酶标抗体与样品中的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF结合，形成免疫复合物。然后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与生物素结合，最后加入底物工作液显色，通过测量OD值来定量检测样本中人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF的浓度。

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)Elisa试剂盒的主要组成包括：

酶标包被板：用于承载固相抗体，通常是微孔板，每个孔都预先包被了抗胰蛋白酶的抗体。

标准品：用于绘制标准曲线，帮助计算样本中AT的浓度。

酶标试剂：即HRP标记的抗体，与样本中的AT结合后形成复合物。

洗涤液：用于洗涤酶标板，去除未结合的成分。

显色剂：与酶标抗体反应后产生颜色变化，用于定量检测AT的浓度。

终止液：用于停止显色反应，以便进行OD值的测定。

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)Elisa试剂盒

使用人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)Elisa试剂盒进行实验时，需要按照以下步骤进行：

实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6.依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。

应用^[4][5]

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)Elisa试剂盒可以用于家蚕生物反应器表达人GM-CSF的研究

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子是一种在体外调控粒细胞、单核／巨噬细胞分化、增殖和存活的造血性糖蛋白细胞因子。本研究成功地利用家蚕核型多角体杆状病毒表达系统在家蚕蛹中表达并纯化出重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。通过RT-PCR技术，我们利用一对特异引物从人胚纤维原细胞中扩增到人GM-CSF基因。将扩增的GM-CSF PCR产物用EcoRI和BamHI酶切后插入到同样酶切的家蚕杆状病毒转移载体pUBM-4中，从而构成了重组载体pBM-CSF。将该质粒与线性化的Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞BmN，在培养的贴壁细胞中挑出空斑，经过3轮纯化，获得重组病毒vBm-CSF。

利用重组病毒vBm-CSF感染家蚕蛹来表达重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。经人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)Elisa试剂盒和Western blotting鉴定表明在重组病毒感染的家蚕蛹体内存在重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。表达产物分子量约为29kDa，在蚕蛹中的表达量约为97μg／蛹；在蚕蛹粗提物中的rhGM-CSF生物活性约为6.8×106cfu／mg。与以前在家蚕细胞和幼虫中分泌表达的hGM-CSF相比，我们在家蚕蛹表达的hGM-CSF表现出较大的差异：分子量较大、表达量和生物活性偏低，这可能与蛋白的翻译后修饰有关。因而，有必要对蚕蛹表达的hGM-CSF进行大量表达和纯化以鉴定该表达产物的相关理化性质。为此，我们将重组病毒接种了大量的蚕蛹来表达hGM-CSF。通过硫酸铵分级沉淀、凝胶排阻过滤和离子交换层析多步纯化，最终我们以10.5％的得率从700头接种重组病毒的家蚕蛹中获得3.5mg纯度达97％的蚕蛹表达产物Bm-hGM-CSF。经人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)Elisa试剂盒检测，高纯度的表达产物Bm-hGM-CSF生物活性达约8.4×106cfs／mg。

参考文献

[1]Expression and one-step purification of bovine interleukin-21(IL-21)in silkworms using a hybrid baculovirus expression system[J].Yoshihiro Muneta;Hidekazu Nagaya;Yu Minagawa;Chiaki Enomoto;Sayaka Matsumoto;Yasuyuki Mori.Biotechnology Letters,2004(18)

[2]Curative potential of GM-CSF-secreting tumor cell vaccines on established orthotopic liver tumors:Mechanisms for the superior antitumor activity of live tumor cell vaccines[J].Kuo-Feng Tai;;Ding-Shinn Chen;;Dr.Lih-Hwa Hwang.Journal of Biomedical Science,2004(2)

[3]Intrinsic glycosylation potentials of insect cell cultures and insect larvae[J].Thomas R.Davis;;H.A.Wood.In Vitro Cellular&Developmental Biology-Animal,1995(9)

[4]Combination of ganciclovir and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in the treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients[J].D.Hardy;;S.Spector;;B.Polsky;;C.Crumpacker;;C.Horst;;G.Holland;;W.Freeman;;M.H.Heinemann;;G.Sharuk;;J.Klystra;;M.Chown.European Journal of Clinical Microbiology&Infectious Diseases,1994(2)

[5]陈健.家蚕生物反应器表达人GM-CSF的研究[D].浙江大学,2006.