Shuffle T7-K12 感受态细胞的质粒转化

背景及概述^[1]

大肠杆菌经Ca离子处理后可摄取外源DNA(Plasmid、Phage DNA)，处于这种状态的细胞称作感受态细胞(Competent Cells)。Shuffle T7-K12菌株来源于大肠杆菌K12菌株，适用于T7启动子启动的蛋白表达。细胞内组成型表达的二硫键异构酶DsbC不仅有利于表达蛋白形成正确的二硫键，并具有分子伴侣的功能，帮助不含二硫键的蛋白正确折叠。T7 RNA聚合酶基因整合在细菌染色体上的lac操纵子区域，组成型表达的lac 阻遏蛋白能降低基因的背景表达，有利于毒性蛋白的表达，没有λ前噬菌体序列，具有抗T1噬菌体感染特点。Shuffle T7-K12感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率大于10⁶ cfu/μg DNA。

基因型^[1]

F′lac, pro, lacIQ / (ara-leu)7697 araD139 fhuA2 lacZ::T7 gene1(phoA) PvuII phoRahpC*galE(orU) galKλatt::pNEB3-r1-cDsbC (SpecR, lacIq) trxB rpsL150(StrR) gor (malF)3

菌株抗性^[1]

对氨苄青霉素，氯霉素，卡那霉素和四环素敏感，对链霉素和壮观霉素有抗性。

质粒转化步骤^[1]

1. 将感受态细胞置于冰水浴中化冻。待细胞刚化冻后，加入 1-5μl 含有 1-100ng 的质粒 DNA 到细胞中，用手指拨打管底，轻轻混匀；

2. 冰水浴中放置 30 分钟，不要晃动；

3. 42℃热击 60 秒钟，不要晃动；

4. 冰水浴中放置 2 分钟，不要晃动；

5. 加入 500μl 的室温的 SOC 或 LB 培养基；

6. 置于 30℃摇床中，150-200rpm，复苏培养 60 分钟；

7. 取 50-100μl 菌液涂布在含有抗性的 LB 平板上。待液体吸干后，倒置平板 30℃培养 12-24 小时。

（平板划线分离法：复苏培养结束后，12000rpm 离心 30 秒钟，弃掉上清，留 100μl 左右的液体，用 200μl吸头轻轻吹打散菌块，取 10μl 重悬的菌液分多点滴在平板上，倾斜吸头，用吸头头部的侧面将滴在平板上的液体来回划线。这个方法可以获得更多更大的单克隆菌落。）

（质粒快速转化步骤：将步骤 2 的时间缩短到 5 分钟，对于氨苄青霉素抗性的质粒，步骤 4 完成后，可直接涂布或划线于含抗生素的平板上。其它抗性的质粒仍需 40-60 分钟的复苏培养。）

蛋白表达步骤^[1]

1. 挑取单菌落，接种到含 5ml 带抗生素的 LB 培养基中；

2. 30℃，200rpm 震荡培养细菌至对数生长期（OD600=0.4-0.8）；

3. 加入 IPTG 到终浓度为 0.4mM，30℃诱导 4 小时或 16℃诱导过夜；

4. 诱导完成后，离心收集菌体，用合适的方法（如考马斯亮蓝染胶法，Western-Blot法或酶活性分析法）分析菌体裂解物的总蛋白、上清和沉淀组分，明确表达产物的表达状况（可溶性或不溶性表达）；

5. 重组蛋白大量表达时，可用 10ml 过夜培养物转接到 1L 培养基中，当培养到 OD600=0.4-0.8 时，加入终浓度为 0.4mM 的 IPTG，30℃诱导 4 小时或 16℃诱导过夜（不同蛋白表达的条件有所不同，需在实验中优化）。

主要参考资料

[1] Shuffle T7-K12 感受态细胞说明书