E2F1抗体的应用

背景^[1-3]

E2F1抗体是一种针对E2F1蛋白的特异性抗体，可用于检测和研究E2F1蛋白的表达和功能。E2F1蛋白是E2F转录因子家族的一员，它在细胞周期调控、DNA损伤修复和细胞凋亡等过程中发挥重要作用。

E2F1抗体有多种类型，包括单克隆抗体和多克隆抗体。这些抗体可以用于不同的实验方法，如Western blot、免疫细胞化学、免疫组织化学、免疫沉淀和流式细胞术等。通过这些实验方法，可以检测E2F1蛋白在细胞和组织中的表达水平，以及与其他分子的相互作用。

E2F1抗体的应用广泛，不仅用于基础科学研究，还用于疾病诊断和治疗监测。例如，在癌症研究中，E2F1抗体的应用有助于了解癌症发生发展的机制，以及评估癌症治疗的疗效。

E2F1抗体

E2F1抗体使用步骤：

样本准备：根据实验需要，准备适当的样本，如细胞裂解液、组织提取物或血清等。确保样本的质量和数量满足实验要求。

抗体稀释：按照产品说明书或实验需求，将E2F1抗体稀释至适当的浓度。通常，抗体会与一定的缓冲液或稀释液混合。

免疫反应：将稀释后的E2F1抗体与样本进行孵育，使抗体与样本中的目标分子结合。这一步可能需要一定的时间和温度条件。

洗涤：孵育完成后，通过洗涤步骤去除未结合的抗体和杂质，以减少背景干扰。

检测与分析：使用适当的检测方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹（Western blot）或流式细胞术等，来检测和分析E2F1抗体的结合情况。根据实验的具体要求，可能还需要进行信号放大、显色或定量等操作。

应用^[4-5]

E2F1抗体可以用于KIF26A在乳腺癌发生、发展中的作用机制研究

KIF26A的核心启动子区位于相对于TSS-395/-385区域内,E2F1通过与KIF26A启动子区直接结合,发挥正向转录调节作用

(1) 成功构建了KIF26A转录起始位点(Tss)上游的2000bp全长及截短序列的PGL3载体,命名为P1-P10,并通过在MCF-7和293T细胞内转染P1-P10 PGL3载体,经双荧光素酶实验验证,确定P6-P7位置,即-415和-360之间序列的缺失显著降低了荧光素酶活性,表明跨越这55bp核苷酸的启动子区是KIF26A基因基础转录活性区域;

(2)通过两个软件分别预测了51个和13个转录因子,其中E2F1和SP1为两个软件均有的转录因子;

(3)成功扩增并克隆了转录因子CREB,SP1,EGR1,KLF5,ELK1,TFAP2A,GCF4,C/EBP alpha和SP3 PcDNA3.1过表达载体,及E2F1 P-ENTER过表达载体。双荧光素酶实验及E2F1抗体证实转染E2F1过表达载体可显著提高KIF26A启动子活性,RT-qPCR实验证实转染E2F1过表达载体可显著提高KIF26AmRNA相对表达水平,提示E2F1对KIF26A的正向转录调节作用;

(4)用突变载体T1、T2或T3联合P6-PGL3质粒和TK质粒转染293T和MCF-7细胞,携带T1的荧光素酶报告基因的活性比携带T2或T3的基因受到更明显的抑制(P值<0.01)。因此,确定预测的E2F1结合位点1(-395/-385)是KIF26A的核心启动子区;

(5)通过CHIP实验,经琼脂糖凝胶电泳分离的PCR产物和RT-qPCR分析表明,KIF26A启动子区域的DNA序列与E2F1抗体洗脱的沉淀蛋白结合,而不与非特异性IgG(阴性对照抗体)结合,表明KIF26A的最小启动子位于相对于TSS-395/-385区域内,直接与转录因子E2F1结合。

KIF26A通过CDK-RB-E2Fs通路促进乳腺癌细胞增殖和细胞周期进展

(1) 通过全人类基因组微阵列芯片及E2F1抗体比较两组间差异,GO分析提示沉默KIF26A后下调的通路中,有与癌症相关的通路,Pathway分析提示与癌症增殖及细胞周期相关的通路;

(2)使用E2F1抗体的Western Blot结果提示KIF26A基因沉默组p21的表达明显升高,CDK2/4/6、CyclinD1/E1、pRB和E2F1均有抑制作用,并在KIF26A过表达组中表达相反,在RT-qPCR结果中CyclinE1、CDK2、CDK6表达有显著差异,其他分子改变不明显,表明KIF26A在蛋白水平抑制p21的表达,然后激活CDK-RB-E2Fs通路。

参考文献

[1]Analysis of Cross-Association between mRNA Expression and RNAi Efficacy for Predictive Target Discovery in Colon Cancers.[J].Jeong Euna;Lee Yejin;Kim Youngju;Lee Jieun;Yoon Sukjoon.Cancers,2020

[2]Ectopic HOTTIP expression induces noncanonical transactivation pathways to promote growth and invasiveness in pancreatic ductal adenocarcinoma[J].Chi Hin Wong;;Chi Han Li;;Qifang He;;Stephen Lam Chan;;Joanna Hung-Man Tong;;Ka-Fai To;;Li-zhu Lin;;Yangchao Chen.Cancer Letters,2020

[3]Overexpression of kinesin superfamily members as prognostic biomarkers of breast cancer.[J].Li Tian-Fu;;Zeng Hui-Juan;;Shan Zhen;;Ye Run-Yi;;Cheang Tuck-Yun;;Zhang Yun-Jian;;Lu Si-Hong;;Zhang Qi;;Shao Nan;;Lin Ying.Cancer cell international,2020

[4]The Atypical Kinesin KIF26A Facilitates Termination of Nociceptive Responses by Sequestering Focal Adhesion Kinase[J].Li Wang;;Yosuke Tanaka;;Doudou Wang;;Momo Morikawa;;Ruyun Zhou;;Noriko Homma;;Yuki Miyamoto;;Nobutaka Hirokawa.Cell Reports,2018

[5]徐静.KIF26A在乳腺癌发生、发展中的作用机制研究[D].山东大学,2022.