RIPA裂解液(弱)的应用

背景^[1-3]

RIPA裂解液（弱）是一种采用温和裂解方法从细胞中提取总蛋白的试剂。它的主要成分包括Tris、NP-40、sodium deoxycholate等，并含有多种蛋白酶抑制剂成分，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。

RIPA裂解液（弱）主要用于细胞的裂解，以释放细胞内的蛋白质。通过裂解过程，可以获得细胞内的总蛋白，这些蛋白可以用于后续的PAGE电泳、Western Blot、免疫沉淀（IP）和免疫共沉淀（co-IP）等实验。这些实验是分子生物学和细胞生物学中常用的研究方法，可以帮助研究人员了解细胞内的蛋白质组成、相互作用以及功能。

使用RIPA裂解液（弱）时，需要注意其保存条件和使用方法。一般来说，RIPA裂解液（弱）应保存在-20℃下，避免反复冻融，以确保其稳定性和有效性。在使用前，可以根据实验需要适当分装，并加入自备的PMSF等蛋白酶抑制剂。

此外，用RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品，可以使用特定的蛋白浓度测定试剂盒（如BCA蛋白浓度测定试剂盒）来测定蛋白浓度。但需要注意的是，由于RIPA裂解液中含有较高浓度的去垢剂，因此不能使用Bradford法来测定其裂解得到的蛋白样品的浓度。

RIPA裂解液（弱）

RIPA裂解液（弱）的步骤如下：

1.样品前处理：

对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗涤细胞。按照细胞量加入适量RIPA裂解液（弱）。用移液器吹打数次，使裂解液和细胞充分接触。

对于组织样品：首先称重组织，并用PBS洗去血污。然后，将洗净的组织转移到干净的EP管中，剪碎。根据组织重量加入适量RIPA裂解液（弱）。

2.研磨与裂解：

将含有组织的裂解液转移到匀浆器中，进行充分研磨至无明显组织块。整个研磨过程需在冰上进行。

将匀浆器放在冰上裂解一段时间（如30分钟），期间需重复研磨几次至裂解液变得清澈。

3.离心与取上清：

使用移液器将裂解液转移到新的EP管中，并在离心机中进行离心（如4°C，16000g离心10分钟）。

离心后，小心吸取上清液，避免吸到沉淀。

4.保存与变性：

将上清液转移到无菌的EP管中，加入适量loading buffer并混匀。

在95°C下加热变性一段时间（如10分钟），完成后将样品保存在-20°C冰箱中。

应用^[4-5]

RIPA裂解液（弱）可以用于不同种属动物红细胞膜大豆凝集素特异性结合蛋白的分离与鉴定

大豆凝集素(Soybean agglutinin,SBA)是大豆中含量较高的一类具有多种生物活性的蛋白质,主要通过与细胞直接或间接的接触而发挥自身特有的生物学功能,其中一个最基本的生物学功能就是能够凝集一些动物的红细胞。已有研究表明,不同种属动物的红细胞对SBA的敏感程度不同,但具体机制尚不明确。本试验选择种属特征明显的奶牛、猪、兔的红细胞作为试验材料,研究不同动物的红细胞膜上与SBA特异结合蛋白种类的异同。试验1:采用低渗溶血法提取牛的红细胞膜,分别用NP-40裂解液、RIPA裂解液(中)和RIPA裂解液(弱)作用于牛红细胞膜,结果显示:NP-40裂解液裂解红细胞膜蛋白的效果优于RIPA裂解液(中)和RIPA裂解液(弱)。比较奶牛、猪和兔的红细胞膜蛋白SDS-PAGE电泳图可发现,三种动物红细胞的膜蛋白组成具有相似性,大部分蛋白分布在25 kDa-250 kDa之间,且高分子量的蛋白占的比例明显高于低分子量的蛋白。同时它们间也存在一定的差异性:奶牛红细胞膜蛋白最为丰富,兔红细胞膜蛋白在180 kDa和45 kDa的蛋白丰富度不如奶牛和猪,而猪红细胞膜在35 kDa处的蛋白丰富度又不如牛和兔。试验2:通过免疫共沉淀(Co-IP)方法得到红细胞膜SBA特异结合蛋白,再用液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)联用的方法对这些蛋白进行鉴定,通过MASCOT(版本号:2.3.0)软件搜库,奶牛评分大于24分、猪评分大于23分、兔评分大于22分的蛋白均为阳性结果。按照蛋白功能可将质谱得到的不同种属动物膜蛋白分为三类:第一类为细胞膜骨架蛋白,第二类为催化酶类蛋白,第三类为功能调节蛋白。其中三种动物的骨架蛋白种类均高于催化酶类和功能调节类蛋白,且评分普遍较高;在不同动物中也检测到了相同的蛋白,但大部分蛋白存在种属差异。研究结果为揭示不同种属动物红细胞对SBA敏感程度差异的机制提供了重要的试验依据。

参考文献

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