4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐的应用

背景^[1-3]

4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（4ˊ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride）是一种常用的荧光染料，主要用于细胞核的染色。它能够与DNA双螺旋结构中的AT碱基对结合，从而在荧光显微镜下产生强烈的蓝色荧光，使得细胞核清晰可见。

4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐

4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐的使用方法通常如下：

细胞固定：首先，需要将细胞固定在载玻片上，这通常通过使用甲醛或甲醇等固定剂来实现。

洗涤：用PBS（磷酸盐缓冲液）或其他适当的缓冲液洗涤细胞，以去除固定剂和其他杂质。

4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐染色：将4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐溶液（通常稀释在PBS中）滴加到细胞样本上，确保细胞被完全覆盖。4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐的染色浓度和染色时间可以根据不同的细胞类型和实验需求进行调整。

再次洗涤：染色完成后，用PBS洗涤细胞，以去除未结合的4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐染料。

封片：使用抗荧光淬灭封片剂封片，以防止荧光淬灭。

观察：在荧光显微镜下观察样本，4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐染色的细胞核应呈现明亮的蓝色荧光。

需要注意的是，4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐是一种有毒物质，使用时应在通风良好的环境中进行，并佩戴适当的防护装备。同时，4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐的荧光强度可能会随时间而减弱，因此建议染色后尽快进行观察。

此外，4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐的荧光激发波长通常在358nm左右，发射波长在461nm左右，因此在使用荧光显微镜时，需要设置合适的激发和发射波长来观察4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐的荧光信号。

应用^[4-5]

4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐可以用于基于PP2A/PP5/AMPK-JNK信号通路的异甘草酸镁/二甲双胍抗镉诱导细胞凋亡分子机制研究

研究采用细胞培养、RNA干扰、Western Blot分析、蛋白荧光标记、HE染色、4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐和TUNEL染色、台盼蓝染色、细胞活性分析等细胞学和分子生物学技术与方法,以ICR小鼠以及L02细胞、AML-12细胞、PC12细胞、SH-SY5Y细胞和小鼠原代神经元为实验对象,通过建立的镉染毒体内和体外模型,综合研究了异甘草酸镁和二甲双胍分别在抗镉诱导肝细胞和神经细胞凋亡中的作用,深入解析了异甘草酸镁和二甲双胍分别通过调控ROS介导PP2A-JNK和PP5/AMPK-JNK信号通路发挥抗肝细胞和神经细胞凋亡分子机理。

结果如下:1异甘草酸镁通过抑制镉诱导肝细胞JNK通路激活抗凋亡L02和AML-12细胞、或分别感染Ad-GFP、Ad-dn-c-Jun的L02或AML-12细胞用异甘草酸镁(10-104μg/ml或100-800μg/ml或400μg/ml)预处理4 h,或用SP600125(20μM)预处理1 h后再用异甘草酸镁(400μg/ml)预处理4 h,接着镉(50μM)处理6 h或24 h。然后,观察细胞形态、台盼蓝染色统计活细胞数量、4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐和TUNEL染色评估细胞凋亡表现、Western Blot检测相关蛋白表达。结果显示,异甘草酸镁显著阻止镉引起的L02和AML-12细胞形态皱缩、细胞活力下降、Cleaved-PARP表达水平升高和细胞凋亡增加;异甘草酸镁阻滞镉激活JNK通路抗肝细胞凋亡,这被JNK抑制剂SP600125和钝化c-Jun表达强化异甘草酸镁抗镉诱导肝细胞活性下降和凋亡的证据支持。提示:异甘草酸镁通过抑制镉诱导肝细胞JNK通路激活抗凋亡。

2异甘草酸镁抑制镉诱导肝细胞ROS依赖的PP2A-JNK信号通路抗凋亡L02和AML-12细胞、或分别感染Ad-GFP、Ad-PP2A-wt的L02或AML-12细胞用10-104μg/ml或100-800μg/ml异甘草酸镁预处理4 h、或用5 m M乙酰半胱氨酸或100 n M冈田酸预处理1 h后再用400μg/ml异甘草酸镁预处理4 h,接着镉(50μM)处理6 h、12 h或24 h。使用CM-H2DCFDA探针检测细胞ROS水平、台盼蓝染色统计活细胞数量、4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐染色评估细胞凋亡表现、Western Blot检测相关蛋白表达水平。结果显示,异甘草酸镁逆转镉和/或冈田酸诱导的肝细胞PP2A失活、JNK激活和凋亡;过表达PP2A强化异甘草酸镁抑制镉诱导肝细胞JNK激活依赖的凋亡;异甘草酸镁抑制镉诱导肝细胞ROS产生;乙酰半胱氨酸增强异甘草酸镁抑制镉诱导肝细胞ROS依赖的PP2A-JNK通路抗凋亡。提示:异甘草酸镁抑制镉诱导肝细胞ROS依赖的PP2A-JNK信号通路抗凋亡。

参考文献

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[5] 陈晓玲.基于PP2A/PP5/AMPK-JNK信号通路的异甘草酸镁/二甲双胍抗镉诱导细胞凋亡分子机制研究[D].南京师范大学,2022.