D341Med （人髓母细胞瘤细胞）的应用

背景^[1-3]

D341Med（人髓母细胞瘤细胞）是一种来源于人髓母细胞瘤的细胞系。髓母细胞瘤是一种恶性脑肿瘤，主要发生在儿童和青少年时期。D341Med细胞系由Friedman等人于1988年从一名患有髓母细胞瘤的男孩身上提取的肿瘤组织中建立。

D341Med（人髓母细胞瘤细胞）具有超二倍体的特性，模态数为49，范围在44至50之间。这些细胞中存在四条标记染色体，包括11HSR，i（17q），der（22）t（1;22）（q12;p12）和8q-。这些染色体的异常可能与髓母细胞瘤的发生和发展有关。

在细胞培养方面，D341Med（人髓母细胞瘤细胞）通常需要特定的培养基和条件来维持其生长和活性。一般来说，这些细胞可以在MEM（ATCC改良）培养基中生长，其中添加有10%的胎牛血清（FBS）、1mM的Sodium Pyruvate和1%的P/S（青霉素/链霉素）。此外，细胞培养的环境也需要保持适当的温度、湿度和二氧化碳浓度。

D341Med（人髓母细胞瘤细胞）具有多种应用价值。首先，它可以作为研究髓母细胞瘤发病机制和治疗的理想模型。通过深入研究这些细胞的生物学特性，科学家们可以更好地理解髓母细胞瘤的生长、分化和转移过程，从而为开发新的治疗方法提供线索。其次，D341Med（人髓母细胞瘤细胞）还可以用于药物筛选实验，以评估不同药物对髓母细胞瘤细胞的疗效。此外，这些细胞还可以用于基因表达分析、信号通路研究等方面。

D341Med（人髓母细胞瘤细胞）

D341Med（人髓母细胞瘤细胞）培养操作

1)复苏D341Med（人髓母细胞瘤细胞）：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)D341Med（人髓母细胞瘤细胞）传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)D341Med（人髓母细胞瘤细胞）冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

D341Med（人髓母细胞瘤细胞）可以用于靶向PBK对髓母细胞瘤细胞增殖及凋亡影响的机制研究

探究关键基因PBK在髓母细胞瘤发生发展中的作用以及PBK作为D341Med（人髓母细胞瘤细胞）瘤治疗靶点的潜力。研究方法通过生物信息学分析验证课题组前期筛选的髓母细胞瘤预后关键基因PBK在不同亚型中的异常表达以及其对各髓母细胞瘤预后的影响。

体外实验采用RT-qPCR和Western blot实验检测靶基因PBK在D341Med（人髓母细胞瘤细胞）细胞系中的基础表达。通过EdU增殖实验、Cell Counting Kit-8(CCK-8)增殖实验检测PBK靶向抑制剂HI-TOPK032对髓母细胞瘤细胞系增殖的影响。通过Annexin V-APC/7-AAD双染细胞凋亡试剂盒检测PBK靶向抑制剂HI-TOPK032对D341Med（人髓母细胞瘤细胞）细胞系凋亡的影响。通过Western Blot实验探究PBK抑制剂HI-TOPK032抑制髓母细胞瘤细胞增殖与诱导细胞凋亡的下游机制。

采用PBK敲减慢病毒构建稳转Daoy与D341Med（人髓母细胞瘤细胞）细胞株,qPCR与Western blot实验验证转染效率。通过上述体外功能实验验证PBK敲减后的Daoy与D341细胞增殖能力以及凋亡水平的变化。体内实验通过立体定位仪与微量注射器建立人髓母细胞瘤原位模型,采用小动物活体光学成像系统检测原位移植瘤小鼠模型的髓母细胞瘤生长情况。研究结果生物信息学分析结果表明PBK的高表达与非WNT亚型D341Med（人髓母细胞瘤细胞）较差的预后显著相关。EdU增殖实验,Cell counting kit-8(CCK-8)增殖实验证明靶向PBK能够抑制髓母细胞瘤细胞的增殖。

Annexin V-APC/7-AAD双染细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡,结果表明靶向PBK能诱导髓母细胞瘤细胞的凋亡。Western blot实验结果提示用PBK抑制剂HI-TOPK-032靶向PBK会导致PBK下游信号分子ER1/2和AKT的磷酸化水平降低以及Cleaved-caspase3的激活,从而抑制Daoy,D341Med（人髓母细胞瘤细胞）的增殖以及诱导肿瘤细胞的凋亡。EDU增殖实验与CCK-8增殖实验结果表明敲减PBK后Daoy与D341Med（人髓母细胞瘤细胞）增殖能力变化无显著性差异,细胞凋亡实验结果显示敲减PBK后D341细胞凋亡水平明显升高,而Daoy细胞凋亡水平变化无显著性差异。

PBK敲减的Daoy与D341Med（人髓母细胞瘤细胞）体外功能实验结果未能完全符合预期,可能原因为PBK敲减效率不够以及体外实验的实验周期较短。小鼠原位成瘤后进行小动物活体光学成像实验结果提示,与空转对照Daoy相比,敲减PBK后的Daoy在原位成瘤小鼠模型中增殖能力明显受到抑制。研究结论靶向PBK可以抑制髓母细胞瘤细胞的增殖与诱导肿瘤细胞凋亡,PBK可能是髓母细胞瘤潜在的预后标志物以及靶向治疗的有效靶点。

参考文献

[1]Next-generation cancer organoids.[J].LeSavage Bauer L;Suhar Riley A;Broguiere Nicolas;Lutolf Matthias P;Heilshorn Sarah C.Nature materials,2021

[2]Cancer:a mirrored room between tumor bulk and tumor microenvironment.[J].HernándezCamarero Pablo;LópezRuiz Elena;Marchal Juan Antonio;Perán Macarena.Journal of experimental&clinical cancer research:CR,2021

[3]Targeting regulator of G protein signaling 1 in tumor-specific T cells enhances their trafficking to breast cancer.[J].Huang Di;Chen Xueman;Zeng Xin;Lao Liyan;Li Jiaqian;Xing Yue;Lu Yiwen;Ouyang Qian;Chen Jianing;Yang Linbin;Su Fengxi;Yao Herui;Liu Qiang;Su Shicheng;Song Erwei.Nature immunology,2021

[4]Medulloblastoma recurrence and metastatic spread are independent of colony-stimulating factor 1 receptor signaling and macrophage survival.[J].Crotty Erin E;Smith Stephanie M C;Brasel Ken;Pakiam Fiona;Girard Emily J;Connor Yamicia D;Zindy Frederique;Mhyre Andrew J;Roussel Martine F;Olson James M.Journal of neuro-oncology,2021

[5]邓瑜豪.靶向PBK对髓母细胞瘤细胞增殖及凋亡影响的机制研究[D].南方医科大学,2023.