软骨细胞的应用

背景^[1-3]

软骨细胞是软骨组织的主要细胞成分，负责维持软骨的结构和功能。这些细胞位于软骨陷窝内，被软骨基质所包围。根据它们的成熟程度，软骨细胞可以分为幼稚的软骨细胞和成熟的软骨细胞。

幼稚的软骨细胞位于软骨组织的表层，体积较小，呈椭圆形，长轴与软骨表面平行。随着软骨的成熟，软骨细胞逐渐增大并变得圆形，细胞核圆形或卵圆形，染色浅，细胞质弱嗜碱性，常见数量不一的脂滴。

成熟的软骨细胞多2~8个成群分布于软骨陷窝内，这些软骨细胞由同一个母细胞分裂增殖而成，称为同源细胞群。在电镜下，软骨细胞有突起和皱褶，细胞质内有大量的粗面内质网和发达的高尔基复合体及少量的线粒体。在组织切片中，软骨细胞收缩为不规则形，在软骨囊和细胞之间出现较大的腔隙。

软骨细胞在维持软骨的结构和功能方面起着关键作用。它们能够合成和分泌软骨基质，包括胶原蛋白、蛋白多糖和其他细胞外基质成分，从而维持软骨的弹性和韧性。此外，软骨细胞还能够感受机械应力，并通过调整细胞内的信号转导途径来适应和响应外部环境的变化。

Chondrocytes Cells(软骨细胞)

软骨细胞培养操作

1)复苏软骨细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)软骨细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)软骨细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

软骨细胞可以用于17β-雌二醇对骨性关节炎软骨细胞mTOR信号通路影响的实验研究

研究17β-雌二醇(E2)是否可以激活软骨细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路,以及如何激活或通过什么样的途径激活mTOR信号通路。通过对这一新的分子机制的探索可能揭示雌二醇对人软骨细胞的生理作用。我们的研究可能为mTOR作为OA治疗的潜在靶点提供依据及对mTOR有效的抑制剂的研究提供参考。

方法:对软骨细胞TC28a2和C28/I2E2在雷帕霉素(mTOR抑制剂)、E2、LY294002(PI3K抑制剂)、或E2与雷帕霉素或LY294002等联合治疗条件下进行孵育。然后,对S6K1、p-S6K1蛋白、蛋白激酶B(AKT),和p-AKT的蛋白水平进行Western blot分析,MMP3或MMP13的mRNA水平进行实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、免疫共沉淀(CO-IP)和蛋白质印迹法(WB)分析以验证雌激素受体α和mTOR信号通路之间的相互作用。结果:p-S6K1和p-AKT(半小时和一小时)在与E2一起培养的Chondrocytes Cells细胞系TC28a2和C28/12E2中均明显升高。mTOR不影响p-AKT的水平,但当与LY294002(PI3K抑制剂)、或E2与LY294002组合的条件下培养,其水平明显减少。当与LY294002一起培养的条件下p-S6K1水平明显减少,但这种影响可由E2与LY294002组合条件下逆转。在与E2一起培养的条件下兔抗mTOR抗体可以与ERα发生共沉淀反应。另外,E2可以通过mTOR信号通道抑制MMP3和MMP13的mRNA水平。

结论:17β-雌二醇可激活软骨细胞mTOR信号通路,其是通过AKT依赖性及非依赖性途径激活人软骨细胞中mTOR信号通路的。

参考文献

[1]Intra-articular administration of gelatin hydrogels incorporating rapamycin–micelles reduces the development of experimental osteoarthritis in a murine model[J].Tokio Matsuzaki;;Takehiko Matsushita;;Yasuhiko Tabata;;Takashi Saito;;Tomoyuki Matsumoto;;Kanto Nagai;;Ryosuke Kuroda;;Masahiro Kurosaka.Biomaterials,2014

[2]The role of PI3K/AKT/mTOR pathway in the modulation of autophagy and the clearance of protein aggregates in neurodegeneration[J].David Heras-Sandoval;;Jazmin M.Pérez-Rojas;;Jacqueline Hernández-Damián;;JoséPedraza-Chaverri.Cellular Signalling,2014

[3]Defective autophagy in chondrocytes with Kashin-Beck disease but higher than osteoarthritis[J].C.Wu;;J.Zheng;;X.Yao;;H.Shan;;Y.Li;;P.Xu;;X.Guo.Osteoarthritis and Cartilage,2014

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[5]陶雨雷.17β-雌二醇对骨性关节炎软骨细胞mTOR信号通路影响的实验研究[D].山西医科大学,2016.