辣根过氧化物酶标记Streptavidin

背景^[1-7]

辣根过氧化物酶标记Streptavidin（链霉亲和素）分子量为66kD，可以高度特异性地和生物素(Biotin)结合。Streptavidin和生物素的亲和常数为Kd=10-15M。Streptavidin是一个4聚体蛋白，可以同时结合4个生物素分子。Streptavidin的中文名为链霉亲和素，从Streptomyces adidinii中纯化获得，和鸡蛋清来源的Avidin(亲和素)在空间结构以及与生物素的亲和力方面具有高度的相似性。

和Avidin不同的是，Streptavidin是一种非糖基化蛋白，并且基本不带电荷。Avidin的pI=～10.5，在中性pH条件下呈碱性。由于Streptavidin和Avidin相比在中性条件下不带电荷，因此Streptavidin的非特异性结合比Avidin低很多，这样检测时的非特异性背景就低很多。因此目前在生物素检测时通常使用Streptavidin替代Avidin。链霉抗生物素蛋白同源四聚体对生物素（也称为维生素B7或维生素H）具有非常高的亲和力。用解离常数（K d）≈10的量级-14摩尔/L，生物素与链霉抗生物素蛋白的结合是自然界中已知的最强的非共价相互作用之一。

由于链霉抗生物素蛋白-生物素复合物对有机溶剂，变性剂（例如氯化胍），去污剂（例如SDS，Triton），蛋白水解酶以及极端温度和pH的抗性，链霉抗生物素蛋白广泛用于分子生物学和生物纳米技术。辣根过氧化物酶最常见的用途是各种生物分子的纯化或检测。强链霉抗生物素蛋白-生物素键可用于将各种生物分子彼此连接或连接到固体支持物上。

需要恶劣的条件来破坏链霉抗生物素蛋白-生物素相互作用，这经常使被纯化的目的蛋白质变性。然而，已经表明，在70℃以上的水中短暂孵育将可逆地破坏相互作用（至少对于生物素化的DNA）而不使变性链霉抗生物素蛋白变性，允许重复使用链霉抗生物素蛋白固体支持物。链霉抗生物素蛋白的进一步应用是用于纯化和检测用Strep-tag进行基因修饰的蛋白质肽。链霉抗生物素蛋白广泛用于蛋白质印迹和与一些报告分子缀合的免疫测定。

应用^[8]

辣根过氧化物酶标记Streptavidin可以用于生物素(Biotin)标记的抗体、核酸、蛋白或其它生物素标记分子的检测。

具体用途包括Western、ELISA、免疫组化或免疫细胞化学、原位杂交、Southern、Northern、EMSA等。在检测细胞内细胞因子的生物素-链霉亲和素免疫细胞化学法的建立及初步应用的实验中建立检测细胞内细胞因子的生物素-链霉亲和素免疫细胞化学法(BSA-ICC)并作临床初步应用。

方法从健康人外周血单个核细胞(PBMC)中富集CD4细胞,加入莫能霉素,用不同浓度的佛波醇酯(PMA)和钙离子载体(A23817)诱导CD4细胞不同时间,比较其胞内表达白细胞介素-2(IL-2)/白细胞介素-4(IL-4)的细胞百分率,确定最适诱生条件;用不同稀释度的IL-2M cAb、IL-4M cAb、不同浓度的生物素化羊抗鼠IgG(b io-SAM IgG)和辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-SA)作棋盘配比试验,确认M cAb、b io-SAM IgG和HRP-SA的最适浓度,根据上述结果建立了检测细胞内细胞因子的BSA-ICC法。

参考文献

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