植物鞘氨醇的应用与制备

发布日期:2024/1/25 8:43:19

介绍

植物鞘氨醇，是一种神经鞘氨醇类化合物，其既是一类最简单的鞘脂类化合物，又是其他鞘脂化合物的主干部分(长链碱基部分)，是鞘脂化合物的特征结构。

植物鞘氨醇.jpg

植物鞘氨醇

应用

植物鞘氨醇在应用于化妆品中，既有可以对位于人体和其他皮肤组织中的双链多脂脂质层细胞进行皮肤渗透性功能改善的基础同时，又同样可以在该亲水层上直接形成一个亲水屏障，具有人体防护和皮肤保水的重要作用。

制备难点

目前鞘脂类的获取方式主要有合成法以及微生物发酵法。植物中魔芋提取的神经酰胺含量为其他植物的十几倍。但植物提取方法受植物生长周期和季节的限制，产量较低。动物中来源于有致病风险的动物脑部，所以不可应用于化妆品中。而化学合成的主要是拟神经酰胺，其结构与神经酰胺相似，功能相似，可应用于化妆品中，目前已有多种拟神经酰胺成功合成，爱茉莉太平洋公司目前已生产出一种新型拟神经酰胺，提高了其溶解度和稳定性，其技术路线是将三羟甲基氨基甲烷溶于二甲基甲醛(DMF)，再溶于三乙胺(Et3N)，30min后加入棕榈酰氯经过一系列反应再引入脂肪酸。但因为在化妆品中应用的植物鞘氨醇主要从动植物中提取。显然，在工业水平上是一种成本很高的方法。化学合成法由于步骤繁琐，副产物较多，合成率较低等缺点，难以实现工业化生产。生物发酵法外界干扰因素较少，可大量生产且降低植物鞘氨醇的价格，更利于其在产品中的广泛应用[2-3]。

菌株制备法

通过酿酒酵母生产植物鞘氨醇的步骤为：将构建的菌株分别在YND固体培养基上划线活化，温度30℃培养箱培养72h，单菌落接种至YPD培养基，培养温度30℃，转速200rpm，培养过夜，作为种子液；取种子液以体积浓度2％的接种量接种至30mL的YPD培养基培养温度30℃，摇瓶转速200rpm，培养96h后，培养物离心收集沉淀。配制山梨醇缓冲液(10mL):1.82g山梨醇、0.042g柠檬酸钠，用10mL p H 5.8的磷酸钾缓冲液溶解，涡旋震荡混匀，超净台中，滤器过滤除菌[1]。

蜗牛酶液的配置：取5mL山梨醇缓冲液加入到装有1g蜗牛酶(厂家：索莱宝，CAS：9032‑75‑1)的棕色瓶中，轻轻摇动混匀，务必使蜗牛酶完全溶解，使用之前用枪头挑一下瓶底，看是否有未溶解的酶，若有沉淀，则继续摇动或用枪头吹吸，使其溶解，得到的溶液为浓度是200mg/m L的蜗牛酶溶液。样品处理：事先称好空的2mL离心管的重量，取4mL酵母发酵液(YPD液体培养基)，室温10000rpm离心1min，称好酵母细胞和离心管的重量，接着200μL无菌水洗涤菌体(吹吸重悬)，室温10000rpm离心1min，弃上清。重复洗涤2‑3次。酵母细胞重悬于500μL巯基化合物中，32℃水浴15‑30min，期间轻轻颠倒离心管两三次，室温10000rpm离心1min，弃上清。将沉淀重悬浮于500uL山梨醇缓冲液中。按照每克酵母细胞，加入40mg蜗牛酶的比例，加适量体积配制的蜗牛酶溶液到酵母细胞溶液中，37℃保温1h。室温10000rpm离心1min，弃上清。离心得到的沉淀用2ml乙醚/水(体积比为8:3)提取两次，合并提取液。收集上层乙醚相，经真空干燥后，溶解500uL甲醇，1：1加入500uL邻苯二甲醛衍生试剂，涡旋震荡10s，室温避光孵15育30min，将植物鞘氨醇样品经0.22μm滤膜过滤后进行HPLC检测。

所述巯基化合物的体系(30mL)：2.4mL的0.5M的EDTA，294μL的巯基乙醇，27.3mL的无菌水。在YPD培养基发酵96h后，代谢改造的菌株相比于出发菌株CEN.PK2‑1D，植物鞘氨醇的产量均有提高，菌株PT06的产量最高，为9.52mg/g干重。

有益效果主要体现在：本发明在高产植物鞘氨醇的酿酒酵母的基础上，构建高效合成植物鞘氨醇的酿酒酵母工程菌株，将LCB4、SHM2、CHA1、ORM2、ELO3、SHM1基因编码的蛋白质的表达降低和利用组成型启动子将TSC10、SYR2、LCB2基因编码蛋白质的表达提高，植物鞘氨醇摇瓶量达到9.52mg/g干重，再通过组成型启动子将HAC1基因编码蛋白质的表达提高，植物鞘氨醇摇瓶量进一步提高了4.34倍，达到41.33mg/g干重，植物鞘氨醇产量达到为目前报道的摇瓶发酵最高产量。5L发酵罐发酵产植物鞘氨醇的产量达到了150.54mg/g干重，滴度为2817mg/L。