胰腺星状细胞的应用

背景^[1-3]

胰腺星状细胞(Pancreatic stellate cells，PSCs)是胰腺中的一种非神经元细胞，也被称为胰腺星形细胞或胰腺星状间质细胞。它们位于胰腺的间质组织中，并与胰腺内分泌和外分泌细胞相互作用。

胰腺星状细胞在胰腺纤维化和炎症反应中起着重要的作用。当胰腺受到损伤或炎症刺激时，PSCs会被激活并转化为成纤维细胞，产生大量的胶原纤维和其他细胞外基质成分，导致胰腺组织纤维化和硬化。这种纤维化过程是慢性胰腺炎、胰腺癌和胰腺囊性纤维化等疾病的重要特征之一。

胰腺星状细胞的激活和增殖受到多种因素的调控，包括细胞因子、生长因子、激素和机械刺激等。其中，血小板衍生生长因子(PDGF)和转化生长因子-β(TGF-β)是两个重要的促激活因子。

近年来，对胰腺星状细胞的研究逐渐成为胰腺疾病研究的热点之一。通过深入了解PSCs的生物学特性和调控机制，可以为胰腺疾病的治疗提供新的靶点和策略。例如，抑制PSCs的激活和增殖可能有助于减轻胰腺纤维化和炎症反应，从而改善胰腺疾病的预后。

胰腺星状细胞

胰腺星状细胞培养操作

1)复苏胰腺星状细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)胰腺星状细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)胰腺星状细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

胰腺星状细胞可以用于基于miR-21对胰腺星状细胞EMT的影响探讨华蟾素改善胰腺癌微环境的机制

肿瘤微环境在胰腺癌生物学特征的形成中具有重要作用,消除癌细胞的同时靶向支持其发展的肿瘤微环境可能是未来胰腺癌治疗的有效方案。胰腺星状细胞(PSC)在胰腺癌微环境中具有核心作用,其活化能促进胰腺癌的侵袭、转移和耐药。其激活的核心事件是上皮-间充质转化(EMT)。TGFβ/Smad通路是导致胰腺癌发生EMT的重要通路。miR-21是与TGFβ1和EMT相关特征最明确的miRNA。中医药治疗胰腺癌具有独特优势,多种中药抗肿瘤的作用与EMT和miRNA的表达变化密切相关。

前期研究显示,运用靶动脉灌注化疗联合华蟾素注射液泵入治疗晚期胰头癌,能够抑制肿瘤生长,缓解癌痛,延长患者生存期,局部疗效较好,但具体机制尚不清楚。为此,本实验用TGFβ1刺激制备胰腺星状细胞体外活化模型,并通过转染使其高表达miR-21,以增强胰腺星状细胞的恶性表型;以华蟾素注射液为干预药物,测定各组中miR-21、TGFβ/Smad通路相关分子、EMT相关分子的基因和蛋白表达水平,分析结果,探讨华蟾素通过miR-21调控活化胰腺星状细胞的EMT表型来影响胰腺癌微环境的具体作用。

[研究目的]明确华蟾素是否可通过miR-21调控TGBβ/Smad信号通路,干预活化胰腺星状细胞的EMT进程,从而影响胰腺癌微环境。进一步阐明华蟾素治疗胰腺癌的机制,以及在胰腺癌治疗中对肿瘤微环境的影响。

[研究方法]运用细胞实验的方法,培养人胰腺星状细胞(PSC),经不同浓度华蟾素注射液、吉西他滨及两种药物联合处理48h后,用CCK-8法检测其对PSC的抑制率。用TGFβ1刺激制备PSC活化模型,在活细胞动态成像系统内观察细胞形态;以华蟾素为药物进行干预,分别命名为TGFβ1组、华蟾素+TGFβ1组、华蟾素组、miR-21高表达组、miR-21抑制剂组、miR-21空转对照组和空白对照组。用Lipo 2000试剂转染miR-21 mimics为miR-21高表达组;转染miR-21 inhibitor为miR-21抑制剂组;转染mimics NC作为空转阴性对照组。用实时荧光测定(qRT-PCR)法、免疫印迹杂交(westernblot)法测定各组中miR-21、TGFβ/Smad通路相关分子、EMT相关分子的基因和蛋白表达水平。分析结果探讨华蟾素通过miR-21调控胰腺星状细胞的EMT表型来影响胰腺癌微环境的具体机制。

[研究结论](1)华蟾素可抑制活化胰腺星状细胞的增殖。使用吉西他滨时联合应用华蟾素可在相同抑制范围内减少吉西他滨用量,起到减毒增效的作用;(2)华蟾素能够下调被TGFβ1激活的PSC中miR-21的表达量,抑制TGFβ1诱导的PSC活化;(3)华蟾素能够通过下调miR-21,抑制活化胰腺星状细胞发生的上皮-间充质转化。(4)华蟾素可通过下调miR-21的表达抑制TGFβ/Smad通路的活性;总结:华蟾素可通过下调miR-21的表达抑制TGFβ/Smad通路活性,降低活化的胰腺星状细胞的增殖活性和形成EMT的能力,从而改善胰腺癌微环境。

参考文献

[1]Hydroxychavicol from Piper betle induces apoptosis,cell cycle arrest,and inhibits epithelial-mesenchymal transition in pancreatic cancer cells[J].Ananda Guha Majumdar;;Mahesh Subramanian.Biochemical Pharmacology,2019

[2]Aqueous extract of clove inhibits tumor growth by inducing autophagy through AMPK/ULK pathway.[J].Li Cong;;Xu Huanli;;Chen Xiaoliang;;Chen Jijun;;Li Xiao;;Qiao Gan;;Tian Ye;;Yuan Ru;;Su Shuonan;;Liu Xiaohui;;Lin Xiukun.Phytotherapy research:PTR,2019

[3]Targeting the tumor microenvironment in pancreatic ductal adenocarcinoma.[J].Pandey Veethika;;Storz Peter.Expert review of anticancer therapy,2019

[4]FTY720 inhibits the activation of pancreatic stellate cells by promoting apoptosis and suppressing autophagy via the AMPK/mTOR pathway[J].Lihua Cui;;Caixia Li;;Ge Gao;;Yuzhen Zhuo;;Lei Yang;;Naiqiang Cui;;Shukun Zhang.Life Sciences,2019

[5]周杰.基于miR-21对胰腺星状细胞EMT的影响探讨华蟾素改善胰腺癌微环境的机制[D].北京中医药大学,2021.