TMB显色液_使用说明书

TMB显色液是一种采用了最新单一溶液TMB显色技术，通过辣根过氧化物酶(HRP)催化TMB显色，用于ELISA等的显色液。本显色液也可以用于检测血液或血红蛋白等样品中的过氧化物酶含量。

通常的TMB显色试剂由多个组份组成，必须在使用前进行配制，并且容易产生沉淀，使用相对不太方
便，并且也容易导致检测结果不太稳定。本TMB显色液采用了最新的TMB显色技术，把所有的相关试剂全部配制在一个溶液中，仅由单一溶液组成，简化了操作步骤，并且使检测结果更加稳定可靠。

TMB，即3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine，是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶或其他适当过氧化物酶的催化下，TMB会产生可溶性蓝色产物。蓝色产物通常可以在370nm或620-650nm测定吸光度。
辣根过氧化物酶催化TMB显蓝色后可以使用2M H2SO4终止反应。加入硫酸后，溶液呈黄色，此时可以在450nm测定吸光度。


图1为TMB显色反应

背景知识
目前酶免疫分析（EIA)技术，已被广泛应用于抗原，半抗原或抗体的定量或定性检测分析。辣根过氧化物酶（HRP)及其偶联物是酶联免疫分析技术中常用的一种酶，由于3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB)在HRP的显色反应体系中，比其它色原具有更高的灵敏度且无致癌性而被广泛应用。TMB主要应用于酶联免疫吸附实验（ELISA)，免疫斑点杂交或者免疫组化以及氯和过氧化氢的检测分析。为了满足不同的试剂盒产品研发与生产以及科研需求，本公司专门研制了针对不同类型的基于HRP的免疫分析用TMB显色液。

产品特点

• 即用型：无需混合，方便快捷，减少误差
• 灵敏度高：不低于A、B液
• 稳定性好：2-8℃保存，有效期不低于36个月；显色终止后读数稳定
• 背景低：底物溶液在650nm检测时检测OD值小于0.04
• 质量可靠：产品批间差异小
• 外观：本试剂一般情况下为无色，有时略显浅蓝色或浅黄色

使用方法
用适当的干净容器（用纯净水反复冲洗），倒出适量的单组分TMB显色液，待达到室温后即可使用。
加液：加完HRP结合物并孵育一定时间后，用适当洗涤液洗板3-5次，每孔加TMB显色液100ul。 根据个人实验需要，在室温（15-25℃）或37℃下避光温育10-30分钟或更长时间，直至显色至预期深浅。
终止：加入等体积的1M 盐酸或硫酸溶液终止反应，孔中反应液由蓝色变为黄色。
读数：终止反应后30分钟内在450nm处测定吸光值。
注意：如果出现高的反应背景或沉淀，表明TMB底物反应过于强烈。为了避免产生沉淀，可在终止后马上读数；或者进一步稀释一抗和/或HRP结合物。

使用说明
1. 对于ELSIA检测：

1.  参考ELISA试剂盒的实验步骤，在与辣根过氧化物酶标记的抗体孵育后，用适当洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟。
2.  洗涤完毕后，去除洗涤液，加入200微升TMB显色液。
3.  室温避光孵育3-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅。
4.  直接在370nm或620-650nm测定吸光度。或加入50微升2M H2SO4终止反应，随后在450nm测定吸光度。

2. 对于在96孔板内进行的其他适当检测 (例如检测组织或细胞样品内源性的过氧化物酶)：

1.  直接在96孔板内每孔加入10-20微升样品。
2.  加入200微升TMB显色液。
3.  室温避光孵育3-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅。
4.  直接在370nm或620-650nm测定吸光度。或加入50微升2M H2SO4终止反应，随后在450nm测定吸光 度。

常见问题
1. 背景显色太深。

• 如果背景(没有样品的对照)显色太深，一方面需考虑使用适当的封闭液进行封闭，例如选购适当的封闭液或使用和一抗相同来源的血清(10%)进行封闭。另一方面，请选购经过适当吸附的二抗，以减小二抗的非特异性吸附。
• 可以考虑缩短显色时间，或降低二抗浓度。另外，选择适当强度的洗涤液，或延长洗涤时间也会有所帮助。

2. 没有显色或显色太弱。

•  适当提高一抗或二抗的浓度。检测二抗效果，滴一滴稀释二抗在离心管内，检测二抗是否可以被正常显色。
•  可以考虑使用更加灵敏的放大检测体系，例如使用生物素检测体系。
•  可以适当延长显色时间。
•  如果上述改进不能获得预期效果，可以考虑更换效果更好的一抗或ELISA试剂盒。