蛋白酶的应用

背景^[1-3]

蛋白酶是一类能够水解蛋白质肽键的酶。蛋白质是由氨基酸组成的大分子有机物，具有复杂的结构和功能。在生物体内，蛋白质需要经历一系列的修饰和降解过程，其中蛋白酶起着关键作用。

蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称，按其降解多肽的方式分成内肽酶和端肽酶两类。前者可把大分子量的多肽链从中间切断，形成分子量较小的朊和胨；后者又可分为羧肽酶和氨肽酶，它们分别从多肽的游离羧基末端或游离氨基末端逐一将肽链水解生成氨基酸。蛋白酶分布很广，天然存在于动植物中，微生物中也广泛存在着蛋白酶，工业上一般是通过微生物发酵的方式生产蛋白酶，主要是用细菌（枯草杆菌）及霉菌（栖土曲霉），有时也用酵母及放线菌。

蛋白酶

蛋白酶在生物体内具有多种功能，包括：

消化作用：蛋白酶参与消化过程，分解食物中的蛋白质，使其变成小肽和氨基酸，便于吸收和利用。

免疫调节：蛋白酶参与免疫系统的调节，如中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)可以降解细菌的细胞壁，促进细菌的吞噬；组织蛋白酶B(CatB)可以降解组织中的纤维蛋白，参与炎症反应和伤口愈合。

细胞信号传导：蛋白酶参与细胞信号传导，如蛋白酶C(PC)可以切割并激活许多生长因子和细胞因子，调节细胞生长和分化。

疾病发生：蛋白酶在某些疾病的发生和发展中起着重要作用，如胰蛋白酶原(trypsinogen)在胰腺炎中过度激活，导致胰腺组织损伤；肿瘤细胞中的蛋白酶可以促进肿瘤的侵袭和转移。

由于蛋白酶在生物体内具有多种功能，因此对其的研究具有重要的生物学意义。目前已经发现了许多种蛋白酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶、组织蛋白酶等，它们在生物体内的调控机制和作用途径也得到了深入研究。

应用^[4-5]

蛋白酶可以用于组织蛋白酶S在类风湿关节炎中的作用

组织蛋白酶S是属于木瓜蛋白酶超家族的一种半胱氨酸蛋白酶,在抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APCs)上高度表达,它对多种蛋白具有催化水解活性,特别是MHCⅡ恒定链(invariant chain,Ii)和细胞外基质成份(弹性蛋白和胶原)。已证实组织蛋白酶S参与多种疾病,如Alzheimer’s病、动脉粥样硬化、哮喘、慢性阻塞性肺病、肿瘤、骨关节炎、神经痛和多种自身免疫性异常等。目前对组织蛋白酶S在RA中的作用研究较少。

最初研究发现,在组织蛋白酶S敲除小鼠中,对胶原诱导关节炎的敏感性显著降低,开始有学者尝试用组织蛋白酶S的抑制剂来治疗RA。此后研究证实,组织蛋白酶S在滑膜中主要由巨噬细胞表达,而成纤维细胞不表达。在RA的滑液中组织蛋白酶S水平可显著升高。在原发性干燥综合征的小鼠模型中发现用组织蛋白酶S的特异性抑制剂(Clik60)可明显减少淋巴细胞浸润,抑制自身抗体产生,促使临床症状的缓解。

进一步说明组织蛋白酶S在自身免疫性疾病的抗原提呈和器官特异性自身免疫病的发生、发展中起重要作用。研究目的：目前国际上对组织蛋白酶S的研究仍较少,且多集中在其抑制剂的制备、慢性神经源性疼痛和肿瘤等方面。根据组织蛋白酶S的作用特点及其他学者的研究,我们提出假说：在RA的发病机制中,组织蛋白酶S除主要的抗原提呈作用外,还在血管翳的形成、细胞外基质的降解及其它蛋白酶的激活中起重要作用,但它的作用可能在RA的早期更显著。

为验证上述假说,我们先进行临床研究,选取符合ACR1987年诊断标准的RA病人,检测其外周血中表达组织蛋白酶S的变化,确认RA病人体内确有组织蛋白酶S表达增多,并与DAS-28和类风湿因子相关。完成临床研究后,再选取C57BL/6小鼠,原代培养小鼠腹腔巨噬细胞、滑膜成纤维细胞、关节软骨细胞和骨髓源性肥大细胞进行体外研究,检测细胞上清中组织蛋白酶S和Ⅱ型胶原的变化。

研究方法：在本研究中,我们收集29个类风湿关节炎病人的血清,其中5个病人进行7次随访,共36例标本。检测血清中组织蛋白酶S、Ⅱ型胶原、IL-17A和TNF-α等指标,用GraphPad Prism5.01和SPSS13.0统计软件进行统计学分析,对正态分布的数据用Mean±SD表示,对两组间数据对比采用t检验方法；对两组间数据相关分析采用Pearson方法；对三组及以上数据间对比采用One way ANOVA方法。对非正态分布的变量用Median±Q表示,对两组间数据相关分析采用Spearman方法；对三组及以上数据采用非参数统计方法,主要是Kruskal-Wallis方法。以上统计方法均以P<0.05有统计学差异。

血清中组织蛋白酶S的表达远高于正常对照组,而且其表达水平高低与类风湿关节炎的疾病活动度相关,并与类风湿因子的高低相关,但与抗CCP抗体的基线水平无关。同时,我们检测了血清中Ⅱ型胶原的水平,后者与类风湿关节炎的疾病活动度、类风湿因子和抗CCP抗体的基线水平均无关,但血清中Ⅱ型胶原的水平与组织蛋白酶S的水平呈弱的负相关(r=-0.3812,P=0.0207)。

在此研究的基础上,我们又收集了18例类风湿关节炎、7例膝骨关节炎和10例痛风患者的膝关节滑液,检测上述关节炎滑液中组织蛋白酶S、IL-17A和Ⅱ型胶原的表达水平,发现组织蛋白酶S在类风湿关节炎和痛风病人的滑液中均显著升高(P=0003);IL-17A在类风湿关节炎滑液中均表达,且远高于骨关节炎和痛风病人(P=0.004),而IL-17A在后两种疾病的少部分患者的滑液中可检测到低水平的表达。

参考文献

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