TOV-112D人上皮性卵巢癌贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

TOV-112D人上皮性卵巢癌贴壁细胞系是从人上皮性卵巢癌组织中分离出的一个细胞系，最初来源于美国加利福尼亚大学洛杉矶分校（UCLA）的Shin Imai博士实验室，标号为TOV-112D。

该细胞系的培养需要特定的培养基，主要成分包括DMEM高糖培养基、10%胎牛血清、1%青霉素链霉素和1%L-谷氨酰胺/丝氨酸等。在培养过程中，温度应控制在37°C，CO2浓度为5%。此外，还需要注意光照、湿度、氧气含量等环境条件。

关于TOV-112D人上皮性卵巢癌贴壁细胞系细胞的分离方法，可以采用组织切碎法、酶消化法、筛选法等。其中，组织切碎法是一种简单、快速、安全的方法，主要是通过切碎组织，使得细胞与基质分离，最终得到细胞悬液。

此外，TOV-112D人上皮性卵巢癌贴壁细胞系传代也是非常关键的步骤。首先将细胞培养液离心，去掉上清液。然后加入PBS缓冲液洗涤细胞2次。接着在细胞培养瓶中加入0.25%胰酶消化液，停留5分钟，观察细胞是否分离。随后加入等量的DMEM/F12培养液，轻轻振荡细胞培养瓶，使细胞充分分散。最后将细胞培养液离心，去掉上清液。加入DMEM/F12培养液，用移液管将细胞重新分装到新的细胞培养瓶中。继续按照之前提到的方法进行细胞培养。

TOV-112D人上皮性卵巢癌贴壁细胞系

TOV-112D人上皮性卵巢癌贴壁细胞系细胞培养操作

1)复苏TOV-112D人上皮性卵巢癌贴壁细胞系细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)TOV-112D人上皮性卵巢癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)TOV-112D人上皮性卵巢癌贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

TOV-112D人上皮性卵巢癌贴壁细胞系可以用于耐药性上皮卵巢癌细胞株（TOV112D/DDP）的Her2表达及其相关信号通路分析

构建顺铂(cisplatin,DDP)耐药上皮性卵巢癌细胞株TOV112D/DDP,并通过蛋白免疫印迹和免疫荧光细胞化学技术检测该耐药癌细胞人表皮生长因子受体Her2(human epidermal growth factor receptor 2)的表达情况和相关信号通路中信号转导子和转录激活子-3(signal transducers and transcription activators 3,STAT-3)的激活情况,探讨上皮性卵巢癌细胞的耐药性与Her2基因表达及其相关信号通路激活的关系,为临床耐药性卵巢癌的治疗奠定理论基础。

方法①顺铂耐药细胞的构建:采用微量递增的方法,利用顺铂构建顺铂耐药上皮性卵巢癌细胞株(TOV112D/DDP);

②顺铂耐药细胞耐药性的评价:MTT实验检测耐药细胞株半数抑制率(half maximal inhibitory concentration of a substance,IC50),评价耐药细胞株的耐药性;

③顺铂耐药细胞中Her2的表达:利用蛋白免疫印迹(Western blot)和细胞免疫荧光组织化学技术(激光共聚焦扫描显微镜)检测TOV-112D人上皮性卵巢癌贴壁细胞系及顺铂耐药细胞株TOV112D/DDP中Her2的表达;

④顺铂耐药细胞TOV112D/DDP中STAT3的表达和激活情况:利用Western blot和激光共聚焦扫描显微镜检测TOV-112D人上皮性卵巢癌贴壁细胞系及顺铂耐药细胞株TOV112D/DDP中STAT3、p-STAT3的表达水平及分布情况。

结果①成功构建顺铂耐药上皮性卵巢癌细胞TOV112D/DDP,MTT检测结果得到TOV112D/DDP细胞对顺铂的耐药系数为4.1429;

②Western blot检测结果显示,与TOV-112D人上皮性卵巢癌贴壁细胞系相比,耐药细胞TOV112D/DDP Her2表达明显上调,激光共聚焦扫描显微镜结果同样显示耐药细胞Her2的表达明显高于非耐药细胞。

③Western blot结果显示,与TOV112D细胞相比,耐药细胞TOV112D/DDP中STAT3表达明显上调。激光共聚焦扫描显微镜检测发现,顺铂耐药细胞TOV112D/DDP中的STAT3较上皮性卵巢癌细胞TOV112D中显著上调,且顺铂耐药细胞的细胞核中STAT3表达上调尤为显著。

④激光共聚焦扫描显微镜检测结果显示,P-STAT3均主要表达于TOV112D和顺铂耐药细胞TOV112D/DDP的细胞核中,Western blot和激光共聚焦扫描显微镜结果均表明TOV112D/DDP细胞中p-STAT3表达较TOV112D细胞明显上调。

结论①成功构建耐药性上皮卵巢癌细胞TOV112D/DDP。

②顺铂耐药细胞TOV112D/DDP中Her2表达较TOV112D细胞显著上调;

③顺铂耐药细胞TOV112D/DDP中STAT3表达较TOV112D细胞显著上调;

④顺铂耐药细胞TOV112D/DDP中STAT3激活水平即p-STAT3表达水平较TOV112D细胞显著上调。该耐药细胞株的构建,为后续耐药上皮性卵巢癌治疗的研究提供了实验依据和研究工具。

参考文献

[1]Expression of Stat3 and Notch1 is associated with cisplatin resistancein head and neck squamous cell carcinoma.Feng Gu;;Yongjie Ma;;Zuping Zhang;;Jinghui Zhao;;Hisayuki Kobayashi;;Lun Zhang;;Li Fu.Oncology Reports,2010

[2]Jnk signaling pathway-mediated regulation of Stat3 activation is linked to the development of doxorubicin resistance in cancer cell lines.Ju-Hwa Kim;;Seok Chul Lee;;Jungsil Ro;;Han Sung Kang;;Hyung Sik Kim;;Sungpil Yoon.Biochemical Pharmacology,2009

[3]EGFR/HER2 in breast cancer:a biological approach for molecular diagnosis and therapy.Milanezi;;Carvalho;;Schmitt.Expert Review of Molecular Diagnostics,2008

[4]How do real tumors become resistant to cisplatin?.Piet Borst;;Sven Rottenberg;;Jos Jonkers.Cell Cycle,2008

[5]陈林.耐药性上皮卵巢癌细胞株（TOV112D/DDP）的Her2表达及其相关信号通路分析[D].贵阳医学院,2020.