CX-1人大肠癌贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

CX-1人大肠癌贴壁细胞系是一种用于研究人大肠癌细胞的细胞系。这种细胞系最初是从一位64岁男性的原发性结肠癌中分离出来的，并且具有稳定的贴壁生长特性。CX-1人大肠癌贴壁细胞系对于研究大肠癌细胞的生物学特性、药物筛选和抗癌治疗等方面具有一定的应用价值。

CX-1人大肠癌贴壁细胞系

一．CX-1人大肠癌贴壁细胞系培养基及培养冻存条件准备：

1）准备1640（推荐YJ-0002）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．CX-1人大肠癌贴壁细胞系细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）CX-1人大肠癌贴壁细胞系细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.

2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

应用^[4-5]

CX-1人大肠癌贴壁细胞系可以用于益气健脾抗癌法对肠癌脾虚本质的影响及抗肿瘤作用实验研究

研究益气健脾抗癌法对肠癌脾虚本质的影响及抗肿瘤的机理，分析肠癌辨证论治规律；进一步证明中医益气健脾抗癌法的治疗作用，深入研究益气健脾和抗癌之间的内在关系，在细胞水平、分子水平、蛋白质水平层面深入揭示益气健脾抗癌法的作用机理，本实验具有较为重要的临床意义。

材料与方法：1.CX-1人大肠癌贴壁细胞系细胞株体外培养：CX-1人大肠癌贴壁细胞系细胞株常规培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养基之中，在37℃，5％二氧化碳100%饱和湿度的培养箱中传代培养，次日观察细胞成活情况。肠癌细胞株HT29为贴壁生长细胞，细胞24小时即进入对数生长期，取对数生长期以上的贴壁细胞，消化后以新鲜培养液配制成1×104个/毫升，96孔板各孔加100μL，置37℃，5％二氧化碳100%饱和湿度的培养箱中培养。24小时后改为成无血清的培养基加受试血清，受试血清加入各孔内（10μL/孔），同一浓度的设3孔，对照孔中加10μL正常血清，调零孔中加100μL培养液。继续培养72小时后，每孔加100μL的5mg/mL的MTT溶液，置于培养箱内4小时后，每孔加100μL溶解液，培养箱内过夜，用全自动酶标仪测570nm处记OD值。取对数生长期的HT29细胞，调整成细胞浓度为5.0×104个细胞/毫升的悬浮液。

2.CX-1人大肠癌贴壁细胞系细胞移植瘤鼠建模：选择对数生长期肿瘤细胞，细胞浓度调至1×107/ml，裸鼠右腋下碘伏消毒，使用1ml注射器在裸鼠右腋下接种肿瘤细胞液0.2ml/只鼠，整个操作过程均要求无菌操作，每天观察肿瘤的生长情况。接种15天后，以在接种部位出现肿瘤结节直径达0.8cm，质地较硬等指标认定为成瘤。

参考文献

[1]Serum carcinoembryonic antigen measurement,abdominal contrast-enhanced computed tomography,and fluorine-18 fluorodeoxyglucose positron emission tomography/computed tomography in the detection of colorectal cancer recurrence:a correlative study.Elgin Ozkan;;Cigdem Soydal;;Mine Araz;;Gulseren Aras.Nuclear Medicine Communications,2012

[2]Circulating VEGF Levels in the Serum of Gastric Cancer Patients:Correlation With Pathological Variables,Patient Survival,and Tumor Surgery.Anastasios J.Karayiannakis;;Konstantinos N.Syrigos;;Alexandros Polychronidis;;Andrew Zbar;;Gregory Kouraklis;;Constantinos Simopoulos;;Gabriel Karatzas.Annals of Surgery,2002

[3]Decreased Production of Interleukin-12 and Type 2 Immune Responses Are Marked in Cachectic Patients with Colorectal and Gastric Cancer.Masahiko Shibata;;Takeshi Nezu;;Hisao Kanou;;Hideo Abe;;Motoo Takekawa;;Masahiro Fukuzawa.Journal of Clinical Gastroenterology,2002

[4]Clinical significance of serum vascular endothelial growth factor incolorectal cancer patients:correlation with clinicopathological factors and tumormarkers..A Takeda;;H Shimada;;H Imaseki;;S Okazumi;;T Natsume;;T Suzuki;;T Ochiai.Oncology Reports,2000

[5]王宁.益气健脾抗癌法对肠癌脾虚本质的影响及抗肿瘤作用实验研究[D].辽宁中医药大学,2015.