大鼠细胞分离液的应用

背景^[1-3]

大鼠细胞分离液是将葡聚糖(右旋糖酐)和泛影酸葡甲胺按一定比例混合，调整比重、pH值和渗透压，经过澄清及除菌过滤后制成一种密度在1.077g/ml并且近于等渗的溶液（分层液），经过密度梯度离心使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。大鼠细胞分离液为带有乳光或微乳光的注射水溶液，主要组成成份是葡聚糖（右旋糖酐）与泛影酸葡甲胺。

大鼠细胞分离液

大鼠细胞分离液样本要求：

大鼠细胞分离液要求血液为新鲜的抗凝血，血液收集时应无菌操作且在储存、处理和运输过程中避免冷冻和冷藏。外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞等细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和白细胞等细胞密度较大，为1.090 g/ml左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090 g/ml，血小板为1.030～1.035 g/ml。

大鼠细胞分离液检验方法

取新鲜抗凝血1ml，与注射用生理盐水1:1混匀后，小心加于2ml的细胞分离液之液面上，以400g离心(半径15cm水平转子)20分钟，此时离心管中由上至下细胞分四层。

层为血浆层；第二层为环状乳白色淋巴细胞；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层。收集第二层细胞放入含注射用生理盐水4-5毫升的试管中，充分混匀后，400g，离心20分钟。沉淀经反复洗2次即得所需细胞。

应用^[4-5]

大鼠细胞分离液可以用于外周血单个核细胞治疗膝骨关节炎的实验研究

研究SD大鼠外周血的细胞种类、含量与人类的相似性,PBMNCs制备方法,PBMNCs中淋巴细胞、单核细胞、干/祖细胞含量,及年龄变化趋势;评估SD大鼠PBMNCs治疗KOA的实验研究对人类开展PBMNCs治疗KOA的参考意义,PBMNCs制备方法的可行性;及选取什么年龄组SD大鼠用于实验的合适性。

方法:全自动血液分析仪检测3、6、12月龄SD大鼠外周血细胞的种类与含量。采用淋巴细胞分离液、不连续密度梯度离心法,制备3、6、12月龄SD大鼠PBMNCs,细胞计数仪检测PBMNCs中细胞种类、含量及淋巴细胞、单核细胞含量随年龄的变化趋势。流式细胞技术检测PBMNCs干/祖细胞含量及年龄变化趋势。

结果:1、血常规检测,SD大鼠外周血细胞由白细胞、红细胞、血小板组成,白细胞又分为中性、嗜酸、嗜碱粒细胞和淋巴细胞、单核细胞,与人类一致。但与人体相比,淋巴细胞、血小板含量高,特别是血小板含量可比人类高2倍左右,单核细胞含量与人类相似。

2、单个核细胞检测,采用淋巴细胞分离液,不连续梯度离心法制备PBMNCs,离心后不同细胞成分分层清晰,获得的PBMNCs主要成分为淋巴细胞、单核细胞和血小板,与人体PBMNCs成分相同;红细胞、粒细胞去除较完全,说明本研究采用的PBMNCs分离方法可行。PBMNCs中淋巴细胞、单核细胞含量随年龄的增长下降趋势明显。

3、PBMNCs中干/祖细胞含量的检测,流式细胞技术检测SD大鼠PBMNCs中干/祖细胞的含量,发现,Nanog、OCT4、SOX2、SSEA4四种干性标志物均有表达,Nanog阳性表达量最低,SSEA4表达最高。四种干性标志物阳性细胞数的变化,总体趋势均为6月龄大鼠干/祖细胞含量最高。

结论:以SD大鼠PBMNCs进行治疗OA的实验研究,对人类开展PBMNCs治疗OA临床研究,有一定参考价值。淋巴细胞分离液,不连续梯度离心法制备大鼠PBMNCs可行。拟进行SD大鼠PBMNCs治疗OA的实验研究,建议选6月龄以下大鼠为宜。

参考文献

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[3]Assessment of safety and efficacy of intra-articular injection of stromal vascular fraction for the treatment of knee osteoarthritis—a systematic review.Saseendar Shanmugasundaram;Abhishek Vaish;Vijay Chavada;William D Murrell;Raju Vaishya.International Orthopaedics,2021

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[5]张文博.外周血单个核细胞治疗膝骨关节炎的实验研究[D].中国人民解放军海军军医大学,2023.