鸟苷-5'-三磷酸二钠盐的一种检测方法

背景技术

鸟苷-5'-三磷酸二钠盐，即是鸟嘌呤-5'-三磷酸或三磷酸鸟苷 (GTP)。在生物化学的全名为9-β-D-呋喃核糖鸟嘌呤-5'-三磷酸，或者是9-β-D-呋喃核糖-2-氨基-6-氧-嘌呤-5'-三磷酸。GTP是DNA复制时的引物(Primer，其实是RNA)和转录(即是mRNA的生物合成)时的鸟嘌呤核苷酸的提供者。它是三羧酸循环中琥珀酰辅酶A转变为琥珀酸过程中的能量载体，它可以和ATP相互转换。是细胞的正常成分，参与许多生化反应，其所含高能键为蛋白质的生物合成(氨基酸的进位和肽链的移位)提供能量。在细胞内GTP在鸟苷酸环化酶的作用下所产生的cGMP与ATP所产生的cAMP共同对细胞功能起着互相制约的调节作用。

鸟苷-5'-三磷酸二钠盐作为含高能量基质和多种酶的激活因子，对神经系统、代谢系统和心血管等有着非常重要的作用。GTP可以调节Ca²⁺诱导的胰岛素分泌，还可以刺激神经轴突的生长等。虽然GTP在生理过程中具有很重要的作用，但由于其它三磷酸物质的共存干扰，使得用简单的方法区分GTP与其结构相似物(如三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸胞苷(CTP)、三磷酸尿苷(UTP)、二磷酸腺苷(ADP)和一磷 酸腺苷(AMP)仍然是一个难题。本文利用PEI包覆Mn掺杂ZnS量子点，不仅简便快速地实现了对GTP的高选择性和高灵敏度检测，而且有效区分了GTP与其结构类似物如ATP、CTP、UTP、ADP和 AMP，并实现了肝癌细胞中GTP的检测，为GTP的检测提供了新方法。

实验方法

1、量子点的合成

在50 mL的微波超声波反应瓶(异口瓶)中加入288mg ZnSO₄·7H₂O和10 mg Mn(CH₃COO)₂，用少量水溶解，再加入750mg用少量水溶解的PEI，用水调整最终溶液体积约为20mL。用6moL／L的HCl调节溶液pH值至4.0，将微波超声波反应瓶放入微波超声波组合合成／萃取仪中。参数设定为目标温度60℃，微波功率500W，超声波功率1000W，时间15min，该过程在氩气氛围中进行。随后加入2.5mL 0.4moL／L的NaS₂·9H₂O水溶液，反应30min，得到PEI包覆的Mn掺杂ZnS量子点。在不加PEI的条件下重复上述操作，得到裸的Mn掺杂ZnS量子点作为对照。分别将所得的PEl包覆和裸的Mn掺杂ZnS量子点按体积比1：1加入无水乙醇使量子点沉降，10000r／min 离心10min，倾去上层清液，所得固体放入真空干燥箱中干燥24 h，得到实验所用的PEI包覆和裸的 Mn掺杂ZnS量子点。

2、室温磷光检测

在10mL比色管中，依次加入1mL pH 7.2的0.1moL／L羟乙基哌嗪乙硫磺酸 (HEPES)缓冲溶液和20ul 20 g/L PEI包覆的Mn掺杂ZnS量子点水溶液，以水稀释定容至10mL并摇匀，依次加入不同浓度的GTP水溶液，静置3min后检测溶液的磷光(激发波长为312 nm)。 

3、癌细胞提取液的制备

肝癌细胞中鸟苷-5'-三磷酸二钠盐按以下步骤提取：(1)HepG2细胞的复苏。从液氮罐中取出冻存管，迅速放入37℃水浴中使其溶解，加入一定量的培养液，800r／min离心3min，弃去上清液，加入培养液4mL，吹打使细胞悬浮。重复上述步骤3次，然后将含细胞的培养液移入培养瓶中。 细胞密度控制在约5×10⁴个／mL，放入37℃ CO₂培养箱中培养；(2)HepG2细胞的培养。培养24 h 后更换培养基，如果镜检观察发现细胞数量很多，则进行传代；(3)HepG2细胞提取液的制备。首先选择体外指数生长的细胞，消化后用血球计进行计数，总量为2.5×10⁷个／mL，然后以800r／min离心3min，并用预冷的PBS洗3次，800r／min离心3min，重悬于0.25 mL预冷的超纯水中，在0℃超声降解20min使细胞壁破裂。为去除溶解产物中的细胞碎片和蛋白，依次用Amicon ultra一4离心膜30kDa和3kDa离心分离(10000r／min×15 min)。将得到的癌细胞提取液准确稀释20倍用于检测。

参考文献

[1]任呼博,杨成雄,严秀平. 微波-超声波辅助合成聚乙烯亚胺包覆Mn掺杂ZnS量子点用于室温磷光检测三磷酸鸟苷[J]. 分析测试学报,2012,31(9):1042-1050.