非洲绿猴肾细胞的应用

背景^[1-3]

非洲绿猴肾细胞是由日本千叶大学的Y·Yasumura和Y·Kawakita从正常成年非洲绿猴的肾脏建株的。1964年6月15日，B·Simizu将Vero细胞从千叶大学带到国立健康研究所(NIH)国立过敏及传染病研究所热带病毒实验室时，已传至第93代。

非洲绿猴肾细胞(Vero细胞）是非洲绿猴肾细胞，是一种异倍体细胞，经猕猴肾细胞培养衍化后产生的，和著名的Hela细胞系、犬肾细胞(MDCK细胞)一样是常用的细胞系。

非洲绿猴肾细胞

非洲绿猴肾细胞培养体系：MEM+10%FBS

非洲绿猴肾细胞培养条件：

气相:空气,95%;CO2,5%;温度:37℃

非洲绿猴肾细胞冻存条件：

基础培养基+8%DMSO+20%FBS，液氮保存

非洲绿猴肾细胞传代步骤

如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次；

加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化；

按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀；

收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:4的比例进行。

非洲绿猴肾细胞冻存步骤

细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数；

4min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x10(6)/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识；

将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

非洲绿猴肾细胞可以用于氧氟沙星和铜及其络合体系对非洲绿猴肾细胞（Vero）的毒性效应

抗生素的滥用使其通过多种途径进入环境,从而产生健康风险。重金属在土壤及水体环境中普遍存在,其隐蔽性强的特性导致它容易通过食物链富集,造成动植物出现重金属中毒。抗生素及重金属在环境中的共存现象非常普遍,并且抗生素易与重金属离子发生络合反应,使它们的环境风险评估变得更加复杂。研究抗生素与重金属对环境中生物的复合风险势在必行。

研究选择抗生素中的代表性物质氧氟沙星(OFL)和重金属中的铜离子(Cu2+)作为实验对象,对离体细胞培养中的模式细胞非洲绿猴肾细胞(Vero)进行复合污染物毒性实验,以此研究抗生素OFL与Cu2+及其复合污染物对Vero细胞的生物效应。通过对比OFL、Cu2+及其复合污染物对Vero细胞的毒性效应的差异研究复合污染与单独污染的区别,并进一步探讨影响氧氟沙星和Cu2+络合物形成的影响因素(pH值和温度)及复合络合体系对Vero细胞的毒性效应。所以本研究对抗生素与重金属复合污染的环境风险研究具有一定理论和实践价值。

结果表明:(1)OFL与Cu2+及其复合污染物会导致细胞形态变化,细胞破碎,贴壁率降低。当Cu2+浓度从6.88 mg·L-1增加到6875 mg·L-1时,其对Vero细胞生长的抑制率也上升了55%。实验表明,OFL对Vero细胞的生长也有显著的影响,当OFL浓度低于3mg·L-1时,OFL促进了Vero细胞的生长;而当OFL浓度高于3 mg·L-1时,Vero细胞的生长则被抑制。

(2) 氧氟沙星和铜复合污染对Vero细胞的毒性与其污染物单独污染时的毒性之和相比有所下降。在2.75 mg·L-1Cu2+浓度时,OFL浓度从0.63 mg·L-1增加到10 mg·L-1时其复合污染物对细胞的抑制率从24%上升到了最高47%。当OFL浓度为2.5 mg·L-1、5 mg·L-1和10 mg·L-1时,OFL与浓度为2.75 mg·L-1 Cu2+的复合物对细胞的抑制率与OFL、Cu2+单一抑制率之和有显著差异,呈现出抑制率下降的趋势。同时,当Cu2+浓度6.88mg·L-1处理下时出现了类似的现象,OFL与浓度为6.88 mg·L-1 Cu2+的复合物对细胞抑制率显著低于OFL、Cu2+单一抑制率之和。

(3) DMEM培养基中OFL与Cu2+的游离的量要显著低于水环境中两者游离的量。说明OFL和Cu2+会与DMEM培养基中其他物质发生反应,形成一个由OFL与Cu2+为主的复合络合体系。

(4) 温度和pH值的变化能够对DMEM细胞培养液中的OFL-Cu2+复合络合体系总浓度产生显著的影响。随着温度的升高,OFL-Cu2+复合络合体系总浓度逐渐增大,这说明温度的升高不但增大了氧氟沙星和铜离子之间的相互作用,还提高了它们与DMEM培养液中其他物质的反应活性。同时,pH值的增大也使得OFL-Cu2+复合络合体系的总浓度上升,这说明pH值的增大能够提高氧氟沙星与铜的反应活性及其络合能力。

(5) OFL-Cu2+复合络合体系不会对Vero细胞的生长产生毒性效应。OFL和Cu2+复合污染毒性与单独污染毒性之和相比有所下降的主要原因之一是在氧氟沙星与铜复合污染体系中DMEM细胞培养液、OFL和Cu2+相互之间发生了反应,形成了OFL-Cu2+复合络合体系,而该体系对Vero细胞的生长产生的影响不显著,从而降低了氧氟沙星和铜复合污染的总体毒性。

由此看来,抗生素OFL与重金属Cu2+对Vero细胞的复合毒性会因为OFL-Cu2+复合络合体系的产生而下降。说明OFL与Cu2+对Vero细胞生长的毒性效应具有拮抗作用。表明环境中污染物间可能存在拮抗作用使复合污染对环境的风险下降。

参考文献

[1]Different types of copper complexes with the quinolone antimicrobial drugs ofloxacin and norfloxacin:Structure,DNA-and albumin-binding..Journal of Inorganic Biochemistry,2012

[2]Correlation of tetracycline and sulfonamide antibiotics with corresponding resistance genes and resistant bacteria in a conventional municipal wastewater treatment plant.Pin Gao;;Mariya Munir;;Irene Xagoraraki.Science of the Total Environment,2012

[3]Effect of ciprofloxacin on microbiological development in wetland mesocosms.Kela P.Weber;;Michael R.Mitzel;;Robin M.Slawson;;Raymond L.Legge.Water Research,2011

[4]Synthesis,characterization,DNA binding properties,and biological activities of a mixed ligand copper(II)complex of ofloxacin.Chang-Yun Chen;;Quan-Zhan Chen;;Xiao-Feng Wang;;Min-Sheng Liu;;Yun-Feng Chen.Transition Metal Chemistry,2009

[5]李祖然.氧氟沙星和铜及其络合体系对非洲绿猴肾细胞（Vero）的毒性效应[D].昆明理工大学,2018.