SDS-PAGE蛋白加样缓冲液(2×)的应用

背景^[1-3]

SDS-PAGE蛋白加样缓冲液(2×)主要由TRIS、SDS、溴酚蓝、还原剂等组成。SDS可与蛋白质结合使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷，这使蛋白质本身的电荷完全被SDS掩盖，消除了各种蛋白质本身电荷的差异；SDS还可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级结构和三级结构。还原剂可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质结构，消除了蛋白结构之间的差异，最终无电荷及结构上差异的蛋白（亚单位），电泳速度只是与其分子量大小有关。溴酚蓝作为电泳指示剂，可大概指示电泳结束的时间。

SDS-PAGE蛋白加样缓冲液(2×)

SDS-PAGE蛋白加样缓冲液(2×)使用说明：

1)在室温或不超过37℃的水浴中溶解SDS-PAGE上样缓冲液(2X)。水浴溶解后立即室温存放。

2)按照每1μl蛋白样品加入1μl蛋白上样缓冲液(2X)的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(2X)。

3) 100℃或沸水浴加热3-5 min，以充分变性蛋白。

注：如果蛋白提取时，起始细胞或组织的用量较大，基因组DNA含量较高，煮沸10分钟后有可能仍然比较粘稠或者有粘稠状的半透明物体。此时需要再煮沸5-10分钟或者补加适量蛋白上样缓冲液后再煮沸3-5分钟。充分煮沸后一方面可以使结合在基因组DNA上的蛋白充分释放，同时会导致基因组DNA的部分断裂从而使粘稠感消失，这样就不会影响后续的上样操作了。

4)冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

5) 通常电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

SDS-PAGE蛋白加样缓冲液(2×)注意事项：

1)蛋白上样缓冲液中含有少量DTT，有轻微剌激气味。

2)刚从冷冻保存中拿出来可能会出现SDS的沉淀，建议可在温水中使它溶解。

3)为了您的安全和健康，请戴一次性手套在通风厨内操作。

应用^[4][5]

SDS-PAGE蛋白加样缓冲液(2×)可以用于深低温停循环后大鼠大脑皮层SDS-PAGE蛋白电泳分析

探讨深低温对缺血缺氧大鼠大脑皮层相关分子量区间蛋白质表达的影响和深低温脑保护的可能机制。

[方法]取SD大鼠48只,随机分为3组：正常对照(NC)组,常温停循环(NTCA)组和深低温停循环(DHCA)组(N=16)。采用体外插管法建立大鼠闭胸式体外循环模型,DHCA组体外循环建立后在深低温(<20℃)条件下停循环10分钟；NTCA组体外循环建立后在正常体温(36.8℃～37℃)条件下停循环10分钟；NC组建立体外循环后不进行降温和停循环过程,保持正常体温(36.8℃～37℃)体外循环20分钟。其后迅速断头取大鼠大脑额顶叶皮质,标本于液氮中保存,组织行SDS-PAGE蛋白质电泳,观察在缺血早期大鼠大脑皮层相关蛋白质的表达情况。

[结果]分子量在43～55KDa区间的蛋白质在深低温停循环组和常温停循环组较正常对照组表达均有明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)；分子量在43-55KDa区间的蛋白质在深低温停循环组较常温停循环组表达有明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。

[结论]缺氧可诱导大鼠大脑皮层分子量在43～55KDa区间的蛋白质的表达,而深低温可以在相同的缺血缺氧条件下促进脑内分子量在43～55KDa区间的蛋白质的高水平表达,从而发挥缺血缺氧下的脑保护作用。深低温增加分子量在43～55KDa区间的蛋白质的表达可能是深低温脑保护机制之一。

参考文献

[1]Pyruvate Effects on Red Blood Cells During In Vitro Cardiopulmonary Bypass With Dogs’Blood.DaMing Gou;;HongJing Tan;;HuiJun Cai;;FangQiang Zhou.Artificial Organs,2012

[2]Pyruvate Protects the Brain Against Ischemia–Reperfusion Injury by Activating the Erythropoietin Signaling Pathway.Myoung-Gwi Ryou;;Ran Liu;;Ming Ren;;Jie Sun;;Robert T.Mallet;;Shao-Hua Yang.Stroke,2012

[3]Pyruvate-Enriched Resuscitation Protects Hindlimb Muscle From Ischemia-Reperfusion Injury.Flaherty,Devin C;Hoxha,Besim;Sun,Jie;Gurji,Hunaid;Simecka,Jerry W;Olivencia-Yurvati,Albert H;Mallet,Robert T.Military Medicine,2010

[4]Pyruvate-Fortified Fluid Resuscitation Improves Hemodynamic Stability While Suppressing Systemic Inflammation and Myocardial Oxidative Stress After Hemorrhagic Shock.Flaherty,Devin C;Hoxha,Besim;Sun,Jie;Gurji,Hunaid;Simecka,Jerry W;Mallet,Robert T;Olivencia-Yurvati,Albert H.Military Medicine,2010

[5]李睿明.深低温停循环后大鼠大脑皮层SDS-PAGE蛋白电泳分析[D].昆明医科大学,2014.