吐温85在螺旋霉素发酵中应用研究

研究背景

螺旋霉素(spiramycin)是一类十六元大环内酯类抗生素，对治疗感染性疾病具有临床应用价值。乙酸激酶、酰基CoA合成酶及碱性磷酸酶 的酶活力提高，可促进生二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)中短链脂肪酸的生成，而较高浓度的短链脂肪酸可刺激螺旋霉素的生物合成。过量铵离子会抑制上述3种酶及螺旋霉素的合成，加入脂肪酸可降低该负效应。在很多微生物研究中，吐温系列产品作为一种非离子表面活性剂应用于细胞质膜系统，促进膜对离子的通透性。吐温85，是含有烯键的聚不饱和脂肪酸，不溶于水，但可在水中分散，具有润湿、扩散等性能。

研究内容

1、发酵培养 

将甘油管中的菌体按6％接种量接入装量为60ml的500ml一级种子瓶，(27±0.5)℃培养42h后按相同接种量接入装量为60ml的500ml二级种子瓶，同温培养24h。再按6％接种量接入装量为7L的10L种子罐，同温培养24h后按相同接种量接入装量为10L的15L发酵罐中培养。

2、吐温85对螺旋霉素的影响

摇瓶实验筛选不同的表面活性剂，选出吐温85作为添加剂。进一步摸索添加时间和添加量，确定0h添加100mg/L ，螺旋霉素的发酵效价达22166u/ml，较对照(20416u/ml)提高了8.57％。将该结论应用至15L发酵罐上，0h时向试验罐中加入100mg/L吐温85，以不加吐温85为对照。结果表明，试验罐初始效价较低，至100h时与对照罐基本一致；到发酵后期，其效价达28176u/ml，较对照罐(25179u/ml)提高了11.9％。 通过显微镜镜检发现加入吐温85会造成菌丝空泡多、舒展状态不佳，因此总糖和氨基氮消耗少，菌体生长时间延长，补料时间随之推迟，较晚进入次级代谢，造成起始效价低。

3、吐温85对细胞通透性的影响

HPLC检测胞内螺旋霉素，发现对照罐在56h和115h胞内有螺旋霉素的积累高峰，分别达2576和2710u/(g蛋白)， 而试验罐为970和2421u/(g蛋白)(为排除菌体生长差异，以单位蛋白表示)。且在整个发酵过程中，试验罐胞内螺旋霉素的效价始终低于对照罐。说明添加吐温85增加了细胞的通透性，利于螺旋霉素分泌到胞外。

4、吐温85对乙酸激酶、酰基CoA合成酶和碱性磷酸酶酶活力的影响

在56h时试验罐的乙酸激酶和碱性磷酸酶有一酶活力峰，分别为359和 0.054u/(mg蛋白)，此时菌体处于生长阶段，大量消耗无机磷，并产生大量菌体所需的乙酰CoA。由于吐温85对菌体有损害，造成前期这两个酶的活力不高。进入次级代谢后，三个酶的酶活力在115~139h达到高峰。从127h起，试验罐中酰基CoA合成酶的酶活力一直高于对照，139h时达到32.8u/(mg蛋白)[对照罐为 26.9u/(mg蛋白)]，约提高了22％。碱性磷酸酶在127h 时酶活力达0.1u/(mg蛋白)，为对照[0.083u/(mg蛋白)] 的120.5％。

5、添加吐温85对有机酸的影响

除琥珀酸和乙酸，试验罐其余所测得有机酸含量均约为对照罐的70％，且变化趋势基本一致(数据未列出)。试验罐中琥珀酸有积累，其胞内含量是柠檬酸和苹果酸的两倍。琥珀酸可提供丙酸，且琥珀酰CoA与琥珀酸之间的转化是可逆的，因此琥珀酸的积累意味着可提供足够的琥珀酰CoA，即可提供螺旋霉素大环合成所需的前体—甲基丙二酰CoA。琥珀酸的趋势变化主要来自胞内（图1），说明吐温85的添加引起了细胞内代谢的变化。试验罐中后期积累的琥珀酸量相对更多，消耗较快，因此可提供较多的前体。

结论

吐温85可以增加细胞膜的通透性，提高乙酸激酶、酰基CoA合成酶和碱性磷酸酶的酶活力，并促进菌体对油的利用，提供更多的前体，从而提高螺旋霉素的产量。

参考文献

［1］朱凤,陈长华,张琪. 吐温-85对螺旋霉素发酵过程的影响[J]. 中国医药工业杂志,2008,39(3):176-178.