人肾透明细胞腺癌细胞的应用

背景^[1-3]

人肾透明细胞腺癌细胞源自一个原发性透明细胞癌。人肾透明细胞腺癌细胞(786-O)有微绒毛和桥粒，能在软琼脂是生长。人肾透明细胞腺癌细胞(786-O)生成的一个PTH样的多肽与乳癌和肺癌中的肽相似。这个多肽的N端与PTH相似，活性与PTH相似，分子量为6000道尔顿。

人肾透明细胞腺癌细胞

人肾透明细胞腺癌细胞培养步骤：

一．人肾透明细胞腺癌细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基；北美胎牛血清，10%；双抗1%。

2）人肾透明细胞腺癌细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）人肾透明细胞腺癌细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．人肾透明细胞腺癌细胞处理：

1）复苏人肾透明细胞腺癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）人肾透明细胞腺癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）人肾透明细胞腺癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

1．细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

人肾透明细胞腺癌细胞可以用于LY294002抑制PI3K/AKT信号通路对人肾透明细胞腺癌细胞增殖和凋亡的影响

应用PI3K高特异抑制剂2－（4－吗啉基）－8－苯基－4氢－1－苯并吡喃－4－酮（LY294002）作用于人肾透明细胞癌786-0细胞系，探讨LY294002对人肾透明细胞癌细胞凋亡的影响及机制，从而为其临床治疗的研究奠定基础。

方法（1）人肾透明细胞癌786-0细胞系培养，建立细胞模型。

（2）将对数生长期的肾透明细胞癌细胞分组培养。用不同药物浓度的LY294002(5μg/mL,10μg/mL,20μg/mL,40μg/mL)处理肾透明细胞癌细胞,MTT法检测癌细胞在不同的作用时间(24h、48h、72h)下的OD值，计算增殖抑制率,绘制肾癌细胞浓度-抑制率曲线及时间-抑制率曲线。用Hoechst染色法观察肾透明细胞癌细胞，经LY294002(5μg/mL,10μg/mL,20μg/mL,40μg/mL）不同的作用时间(24h、48h、72h)下,细胞凋亡情况。

（3）采用RT-PCR法分别检测LY294002在不同浓度及时间点对786-O细胞处理后细胞的PI3K、mTOR、Akt mRNA的表达情况，探讨其对PI3K、mTOR、Akt mRNA表达的影响，及其对786-O细胞增殖的影响。

结果（1）通过MTT法检测LY294002在24、48、72h均表现出增殖抑制作用，当LY294002浓度从1μg/mL增加到40μg/mL时，作用24h细胞抑制率从6%增加到55%，作用48h时，细胞抑制率从12%增加到78%，作用72h时细胞抑制率从14%增加到84%，同一时间不同浓度的各组细胞与阴性对照组相比，抑制率有统计学意义（P<0.05或0.01），提示随着LY294002浓度的增加，其抑制786-O细胞增殖的作用逐渐增加。用倒置显微镜下观察LY294002用药对786-O细胞生长及形态的影响，各浓度LY294002作用48h时细胞形态变化最为典型。结果显示，相对于正常细胞，LY294002可以令细胞生长受到不同程度的抑制，表现出浓度依赖性变化。正常细胞的形态整齐，边缘清晰，细胞排列紧密，而随药物浓度的增加，药物作用下细胞变圆漂浮无法正常贴壁，细胞固缩，细胞密度减少。

（2）通过Hoechst染色法在荧光显微镜下观察对照组细胞核呈弥散均匀淡蓝色的荧光；出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状亮蓝色荧光；相对于未经药物处理的786-0细胞，1μg/mL的药物处理48h后，细胞形态还未出现明显的变化；2.5μg/mL药物处理可见个别细胞内出现染色质凝聚，出现凋亡小体；5μg/mL药物处理染色质荧光增强，出现凋亡小体的细胞增多；10μg/mL药物处理可见凋亡前期的细胞进一步增多；20μg/mL药物处理可见凋亡小体突破细胞膜开始释放；40μg/mL药物处理可见大部分细胞凋亡小体释放，完成凋亡。

（3）在LY294002处理细胞48h，采用1、2.5、5、10、20、30、40μg/mL浓度处理下，PI3K、Akt、mTOR mRNA的表达显著受到抑制，并且呈现出随药物浓度的变化出现抑制程度增大的正比关系；细胞增殖实验显示随着药物浓度及其作用时间的延长，其抑制肿瘤作用逐渐增加。

参考文献

[1]Targeting the PI3K–AKT–mTOR pathway:progress,pitfalls,and promises.Timothy A Yap;;Michelle D Garrett;;Mike I Walton;;Florence Raynaud;;Johann S de Bono;;Paul Workman.Current Opinion in Pharmacology,2008

[2]mTOR:a protein kinase switching between life and death.Laura Asnaghi;;Paola Bruno;;Marcella Priulla;;Angelo Nicolin.Pharmacological Research,2004

[3]Apoptosis incidence and protein expression of p53,TGF-βreceptor II,p27 Kip1,and Smad4 in benign,premalignant,and malignant human prostate 1 1 Accepted for publication 0,2003..Li Zeng;;Randall G Rowland;;Subodh M Lele;;Natasha Kyprianou.Human Pathology,2004

[4]Potentiation of paclitaxel cytotoxicity in lung and esophageal cancer cells by pharmacologic inhibition of the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B(Akt)–mediated signaling pathway.Dao M Nguyen;;G.Aaron Chen;;Rishindra Reddy;;Wilson Tsai;;William D Schrump;;George Cole;;David S Schrump.The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery,2004

[5]杨金成.LY294002抑制PI3K/AKT信号通路对人肾透明细胞腺癌细胞增殖和凋亡的影响[D].宁夏医科大学,2014.