多肽合成常用的三种缩合剂HOBT、HBTU、TBTU

本文主要介绍多肽合成中常用的三种缩合剂HOBT、HBTU、TBTU，用于固相多肽合成中的缩合效果。

HOBT是防止多肽合成中消旋，HBTU、TBTU是多肽合成中强的缩合试剂。

【缩合剂HBTU与TBTU的区别】
HBTU 和TBTU 是HOBt的加强型，效果更好，反应后生成HOBT。
HBTU的价格便宜一些，100g，350元左右T。
TBTU 贵一些。
缩合效果TBTU 稍微好一些的。

【TBTU】
在众多的耦联剂中，脲离子型多肽缩合剂TBTU应用范围最广，性价比最高。脲离子型多肽缩合剂，是一种活化羧酸的多功能试剂。它们一步就可以使氨基酸与胺反应结合，不需要预先活化酸类。它们的优点包括方便实用的反应过程，快速的原位活化，最小的副反应，商业可用性，稳定性，能溶解在宽范围的溶剂包括水和方便去除耦合的副产物。由于脲离子型多肽缩合剂具有非常好的实用性，现在开发它们的多元化应用成为一个新的研究热点。
1、以TBTU为偶联剂，乙腈为溶剂，不同磺酸与不同肟在50℃下收率良好地合成了一序列磺酸肟酯。这个方法的好处是反应过程简便、环境无危害和后处理简洁。
2、以TBTU为偶联剂，乙腈为溶剂，羧酸与杂环仲胺比如吲哚、咪唑等在一般温度下收率良好地合成了一序列的羧酸杂环仲胺类化合物。副产品对环境污染小，产品易于分开，反应过程简便是此法的长处。
3、以TBTU为偶联剂，乙腈为溶剂，羧酸与叠氮化钠、胺类或醇类合成了一序列的脲和氨基甲酸酯类化合物。本法使用了一锅法操作，不仅操作方便，而且产率高。

【HOBT】
HOBt是常用的酰胺缩合剂，就是把有机酸和有机胺形成酰胺的缩合剂。
HOBt的结构是一个苯并三氮唑结构，所以水溶性有但不高，也就是微溶，反应过程一般不用水相的，一般用非水溶剂，比如四氢呋喃，二氯甲烷这种溶剂。
HOBt由于有三氮唑结构，所以无机酸水溶液可以溶。有机酸里面除了甲酸，乙酸这种还能做溶剂，其他的大多室温就是固体一般都不是溶剂。

【HBTU缩合剂反应机理】
酸和胺的缩合中HBTU缩合剂反应机理：直接用酸活性太低，把酸跟缩合剂如HBTU和二乙基氰基磷酸酯先反应生成一个大的取代基（活化步骤），然后很容易就被氨基取代。


图1为HBTU缩合剂反应机理

【多肽合成缩合剂】
高效的多肽缩合剂一直是多肽领域的研究热点，也是高效地合成结构越来越具有挑战性的生物活性肽和多肽类似物的保障。
目前，已报导的多肽缩合剂很多，但影响较大，应用较为广泛的缩合剂从分子结构角度主要分为碳二亚胺类型、磷正离子类型和脲正离子类型。
1. 碳二亚胺型缩合剂：N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)是于1955年开发出来的个碳二亚胺型缩合剂，至今DCC仍是多肽合成中最常用的缩合剂之一。但反应生成的N,N'-二环己基脲(DCU)在大多数有机溶剂中溶解度很小，有时会混在产物中而很难除尽。为此人们在DCC的结构上进行了改进，发展了一些生成水溶性反应副产物的碳二亚胺，如DIC，EDC和BDDC等。通过将碳二亚胺固载在高聚物上得到的缩合剂使反应的后处理更为简单，例如树脂固载的EDC(P-EDC). 这类缩合剂由于价格相对较便宜，因而特别适用于多肽的大规模制备。但在进行片段缩合时，往往会导致产物有较大程度的消旋，为此通常与HOSu，HOBt，HOAt，或HOOBt等添加剂一起使用来抑制产物消旋，同时也可有效地抑制N-酰基脲等副产物的生成。在这些添加剂中以HOBt应用最广。DCC-HOBt复合缩合剂已成为目前应用最广的缩合方法之一。HOOBt虽然与HOBt相比可更有效地抑制消旋，但会产生叠氮化副产物，从而限制了它的广泛应用。HOAt是近几年才发展的新的添加剂，它不仅可以有效地抑制消旋，而且大大提高了反应速度，特别适用于由空间位阻的多肽的合成，但这一试剂价格较贵，不适于多肽的大规模制备。碳二亚胺类缩合剂在多肽合成中的反应中间体主要是O-酰基异脲和羧基组份的对称酸酐(Fig.3)。产物的消旋主要是因为O-酰基异脲和酸酐的分子内环化形成5(4H)-噁唑酮，它很容易脱去 -质子形成共振稳定的噁唑酮负离子。这种噁唑酮负离子可以从分子平面的两侧重新质子化，进一步与氨基组份反应得到消旋的产物。当加入添加剂时，它们可以拦截高反应活性的O-酰基异脲和酸酐中间体生成相应的活化酯，进一步胺解得到目标产物。

2. 磷正离子型缩合剂：采用酰基磷正离子作为活泼中间体用于形成酰胺键是Kenner于1969年首先提出并将这种方法用于多肽的合成，发展出一些能产生此中间体的试剂，如Bate试剂等。这些试剂都因性能较差，产物消旋较大，或操作较复杂而未被广泛使用。直到1975年Castro设计并合成另一个基于HOBt的磷正离子型缩合剂BOP，这类缩合剂才得到人们的重视，并广泛用于多肽的固相法和液相法合成中。但BOP在多肽合成中生成的副产物六甲基磷酰胺具致癌毒性，为此后来又发展了副产物毒性低，反应活性相对更高的缩合剂PyBOP，并已实现商品化。这类缩合剂参与多肽合成反应的机理主要是在碱性条件下羧基负离子进攻缩合剂生成的酰氧基磷正离子，继而此活泼中间体受苯并三唑氧基负离子进攻生成羧基组份的苯并三唑酯，此活化酯再与氨基组份反应得到目标产物。酰氧基磷正离子和生成的少量酸酐也可能直接与氨基组份反应得到相应的肽。尽管这些基于HOBt的磷正离子型缩合剂在含普通氨基酸的多肽的合成中表现出优异的性能，但在有空间位阻的多肽合成中结果却不令人满意，产物的收率低并伴有较大程度的消旋。而后来发展起来的基于HOAt的磷正离子和 -卤代的磷正离子型缩合剂满足了这一要求，例如AOP，PyAOP，BrOP，PyClOP，PyBrOP等。这些缩合剂可以高效地促进有空间位阻的酰胺键的形成，并广泛用于富含N-甲基氨基酸或C ,C -二烷基化氨基酸的多肽和生物活性肽的合成中。不足的是这些基于HOAt的试剂价格昂贵不适于多肽的大规模制备，而 -卤代的磷正离子型缩合剂在进行片段缩合时，产物伴有较大程度的消旋，并且对于羧基组份为叔丁氧羰基保护的氨基酸的缩合反应产物的收率很低。
 
3. 脲正离子型缩合剂：自1978年Dourtoglou成功地将基于HOBt的脲正离子HBTU用于多肽合成中来，这一类型缩合剂得到迅速的发展，并先后开发出一系列基于HOBt、HOAt、HOOBt和HOPyU等的正离子型试剂。例如TBTU、HBPyU、HBPipU、HBMDU、HATU、HAPyU、HAMDU、TAPipU、HDTU、HPyOPfp、HPySPfp、HAPyTU、TOTU、HAPipU。这些缩合剂在多肽合成中均表现出较好的性能，具有反应速度快，产物消旋小、收率高等诸多优点，特别是基于HOBt和HOAt的试剂。其中基于HOAt的脲正离子型缩合剂可有效地促进有空间位阻的酰胺键的形成。但是这类基于HOAt的缩合剂在多肽合成中，会与氨基组份反应生成相应的胍衍生物，这一副反应在片段缩合和环肽的合成中是不容忽视的。虽然HBTU、HBPyU等HOBt衍生的脲正离子型试剂几乎不存在此副反应，但它们在富含N-甲基氨基酸的多肽的合成中产物的收率和旋光纯度都较差。在这种情况下， -卤代脲正离子型缩合剂越来越显现出其在有空间位阻的多肽合成中的重要地位。在这类缩合剂中以PyCIU、TFFH、BTFFH、CIP，和CTDP应用较为广泛，并已被成功地用于含有N-甲基氨基酸和C ，C -二烷基化氨基酸的多肽的合成中。遗憾的是这类试剂与 -卤代磷正离子型缩合剂在片段缩合过程中产物的消旋较大。与磷正离子型缩合剂类似，HOBt和HOAt衍生的脲正离子型缩合剂参与多肽缩合反应的主要中间体分别是羧基组份的苯并三唑酯和7-氮杂苯并三唑酯。当 -卤代脲正离子型缩合剂参与多肽合成时，反应的活泼中间体主要是羧基组份的酰卤和酸酐。
 
4. 其它类型的缩合剂：除上述几大类型的缩合剂外，一些其它类型的缩合剂在多肽合成中也有一定程度的应用，其中有代表性的主要有：BOP-Cl、FDP、FDPP、DEPBT、EDQ等。其中BOP-Cl可以高效地促进有空间位阻的酰胺键的形成与消旋较小，并成功地用于富含N-甲基氨基酸的生物活性肽的合成中。但这一缩合剂会与游离的氨基酸反应，特别是党氨基酸组份是伯胺时，不能通过一锅法制被多肽。FDP和FDPP都是无氟苯酚衍生物的试剂，在多肽合成中具有产物收率高，后处理简单的优点，但不适于有空间位阻多肽的合成。FDPP特别适用于环肽的合成。DEPBT是HOBt衍生的磷酸酯，其特点是产物的消旋较小。EEDQ是一经典的缩合剂,它主要是通过形成混合酸酐中间体促进多肽的合成,不足的是产物的消旋较大. 综合分析上述碳二亚胺、磷正离子和脲正离子等几大类型的缩合剂,以磷正离子和脲正离子型缩合剂性能.无论是反应活性，还是产物的收率和光学纯度方面，这两类缩合剂都优于其它类型的缩合剂。而脲正离子型缩合剂各方面的性能在一定程度上又优于相应的磷正离子型缩合剂。尽管如此，Young's test显示脲正离子型试剂HBTU、HBPyU和HAPyU在模拟二肽的合成中仍分别有25.4%、18.0%和13.9%的消旋。因此，设计、合成反应活性更高、产物消旋更小的新型多肽缩合剂用来高效地合成多肽以及生物活性肽仍是目前多肽合成领域亟待解决的问题。

多肽合成中常用的缩合剂有BOP reagent, PyBOP, HBTU, TBTU, HOBt,EDC·HCl等。

【参考资料】
http://blog.sina.com.cn/s/blog_6850a8080100klws.html
http://emuch.net/html/201108/3500372.html
http://www.zybang.com/question/391b3e5cec84796807e2d1b623724374.html
https://www.chemicalbook.com/ProductChemicalPropertiesCB3357547.htm
https://www.chemicalbook.com/ProductChemicalPropertiesCB2420172.htm
https://www.chemicalbook.com/ProductChemicalPropertiesCB1138465.htm
http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10431-1014246488.htm