小鼠乳腺癌细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠乳腺癌细胞是从410.4瘤株中未经诱变筛得的6-硫鸟嘌噙抗性细胞株。当注射到BALB/c小鼠中时，小鼠乳腺癌细胞自发产生高转移肿瘤，可转移到肺，肝，淋巴结和大脑，同时在注射部位形成始发灶。诱导转移时不需要摘除始发灶。

小鼠乳腺癌细胞细胞在BALB/c小鼠中的生长与转移特性与人体中的乳腺癌十分相近。这种肿瘤是人VI期乳腺癌的动物模型。小鼠乳腺癌细胞-诱导的肿瘤在手术后及未手术情况下转移的动力学相近，可以用作手术后及未手术模型。跟其他肿瘤模型相比，由于小鼠乳腺癌细胞的抗6-硫鸟嘌噙特性，微小的转移细胞团(少到仅仅1个)也可以在许多远端器官中检测到。

小鼠乳腺癌细胞

小鼠乳腺癌细胞培养操作：

1)复苏小鼠乳腺癌细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心3分钟，弃去上清液，补加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入

培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中），加入约8 mL培养基，培养过夜培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2)小鼠乳腺癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-3min（视细胞消化情况而定），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)小鼠乳腺癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

小鼠乳腺癌细胞可以用于CombretastatinA-4（CA4）抑制乳腺癌细胞增殖和迁移侵袭作用的研究

从细胞生长、凋亡、细胞形态、迁移、侵袭、裸鼠成瘤等方面系统地探究CombretastatinA-4(CA4)对三阴性和Luminal型乳腺癌细胞的作用及其分子机制,以推动CA4的进一步应用,为CA4作为治疗乳腺癌的临床药物提供前期基础。

方法:以两种不同的乳腺癌细胞系:MDA-MB-231(ER-,PR-,HER2-三阴性)和MCF-7(PR+,ER+,HER2-Luminal型)为作用对象,评估CombretastatinA-4(CA4)对不同类型乳腺癌细胞的抗肿瘤作用。CCK-8法检测CA4对MDA-MB-231和MCF-7细胞增殖的影响,流式细胞术分析不同浓度CA4刺激对MCF-7细胞周期和凋亡的影响。

免疫荧光染色观察CA4刺激后细胞形态变化情况。Wound healing实验和Transwell实验评估CA4处理后乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的变化。RT-PCR和Western blotting检测不同浓度CA4刺激乳腺癌细胞后EMT相关转录因子和标志物表达水平的变化情况。此外,裸鼠成瘤实验进一步探究CA4在体内对乳腺肿瘤的作用效果。

结果:与Erianin相比,CombretastatinA-4(CA4)在较低剂量下抑制了MDA-MB-231(ER-,PR-,HER2-三阴性)和MCF-7(PR+,ER+,HER2-Luminal型)乳腺癌细胞的生长和增殖,并使MCF-7(PR+,ER+,HER2-Luminal型)乳腺癌细胞周期被阻滞在G2期,而且CA4还诱导了MCF-7细胞凋亡。CA4改变了乳腺癌细胞偏间质特征的形态,使其更倾向于呈现上皮细胞表征。

重要的是,与Erianin相比,CA4对MDA-MB-231(ER-,PR-,HER2-三阴性)和MCF-7(PR+,ER+,HER2-Luminal型)细胞的迁移和侵袭显示出相对更强的抑制作用。相应地,CA4处理后,乳腺癌细胞中有利于EMT发生的转录因子或表明其发生的间质标志物,如ZEB1、Snail家族和Vimentin、N-cadherin的转录或翻译水平下降,而E-cadherin等有利于细胞呈现上皮形态的标记物的转录或翻译水平升高。

值得注意的是,在不同类型乳腺癌细胞中,CA4处理后都观察到Slug蛋白表达水平的明显下降。此外,CA4能够抑制MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞异种移植瘤模型小鼠体内肿瘤的生长。

结论:CombretastatinA-4(CA4)通过使乳腺癌细胞发生周期阻滞、诱导凋亡进而对乳腺癌细胞的生长和增殖产生抑制作用。最为重要的是,CA4显著抑制三阴性(ER-,PR-,HER2-)和Luminal型(PR+,ER+,HER2-)乳腺癌细胞的迁移和侵袭,其作用机制是调控EMT的发生,Slug是其发挥作用的关键因子。CombretastatinA-4(CA4)是一种潜在的应用前景广阔的抗肿瘤药物。

参考文献

[1]Erianin inhibits human lung cancer cell growth via PI3K/Akt/mTOR pathway in vitro and in vivo..Zhang HuiQiong;Xie XiaoFang;Li GangMin;Chen JunRen;Li MengTing;Xu Xin;Xiong QiuYun;Chen GuanRu;Yin YanPeng;Peng Fu;Chen Yan;Peng Cheng.Phytotherapy research:PTR,2021

[2]Ecust004 Suppresses Breast Cancer Cell Growth,Invasion,and Migration via EMT Regulation..Liu Ziyu;Huang Leilei;Sun Liwei;Nie Hui;Liang Yuqi;Huang Jinwen;Wu Fanhong;Hu Xin.Drug design,development and therapy,2021

[3]Vascular disrupting agents in cancer therapy.Smolarczyk Ryszard;Czapla Justyna;Jarosz Biej Magdalena;Czerwinski Kyle;CichońTomasz.European Journal of Pharmacology,2020

[4]Dual Targeting of Cell Growth and Phagocytosis by Erianin for Human Colorectal Cancer..Yihan Sun;;Guofeng Li;;Qi Zhou;;Danyue Shao;;Jingwei Lv;;Jianhua Zhou.Drug design,development and therapy,2020

[5]范明月.CombretastatinA-4（CA4）抑制乳腺癌细胞增殖和迁移侵袭作用的研究[D].吉林大学,2022.