COLO-201细胞系|人结肠癌细胞的应用

背景^[1-3]

COLO-201细胞系|人结肠癌细胞源自一位70岁白人男性的结肠腺癌腹水，CSAp(CSAp-)和CEA阴性。

COLO-201细胞系人结肠癌细胞

COLO-201细胞系|人结肠癌细胞培养步骤:

一、复苏COLO-201细胞系|人结肠癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

二、COLO-201细胞系|人结肠癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a）、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

三、COLO-201细胞系|人结肠癌细胞冻存：

1、细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2、添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3、用适量的冻存液重悬细胞，并放置于冻存管中；

4、先将细胞冻存管放置于-20℃1.5h，然后将其移入-80℃

应用^[4][5]

COLO-201细胞系|人结肠癌细胞可以用于氯离子/碳酸氢盐转运体SLC26A9在结直肠癌发生发展中的作用及分子机制研究

结直肠癌(CRC)是一种常见的恶性肿瘤,是威胁人类健康的重要原因之一。SLC26A9(Solute carrier family 26 member 9)是多功能阴离子转运体SLC26A家族中的一员,具有Cl-通道的功能。我们之前的研究表明,SLC26A9缺失导致小鼠胃癌的发生,这首次证明了它在肿瘤发生中的作用。然而,SLC26A9在CRC发生发展中的作用机制尚不清楚。

方法:1)用IHC检测人正常结直肠黏膜、癌前疾病(结直肠息肉、腺瘤)和结直肠癌组织中SLC26A9的表达量以及临床病理学特征的相关性分析。

2) 运用WB技术检测人正常结直肠组织、结直肠癌组织中SLC26A9的表达量。q PCR与WB方法比较SLC26A9在不同结直肠癌细胞系中的表达。

3) 在COLO201细胞株中构建沉默SLC26A9稳定株;在SW48细胞株中构建过表达SLC26A9稳定株;通过q PCR和WB分别验证沉默/过表达SLC26A9基因是否成功。

4) 在COLO201沉默稳定株中,通过CCK-8增殖实验和细胞周期实验,检测沉默SLC26A9基因后(即沉默组),比较空转组与沉默组细胞的增殖能力。

5) 在COLO201沉默稳定株中,运用流式细胞凋亡实验,检测沉默SLC26A9基因后(即沉默组),比较空转组与沉默组细胞凋亡情况。

6) 在SW48过表达稳定株中,通过CCK-8增殖实验、生长曲线实验、Ki67、克隆形成实验和流式细胞周期实验,检测过表达SLC26A9基因后(即过表达组),比较空转组与过表达组的细胞增殖能力。

7) 在SW48过表达稳定株中,通过划痕实验,检测过表达SLC26A9基因后(即过表达组),比较空转组与过表达组细胞的迁移能力。

8) 在SW48过表达稳定株中,运用流式细胞凋亡实验,检测过表达SLC26A9基因后(即过表达组),比较空转组与过表达组细胞凋亡情况。

9) 运用裸鼠皮下成瘤实验检测人COLO201细胞沉默SLC26A9后,空转组与过表达组的成瘤情况。

10) 运用肺转移瘤实验检测通沉默SLC26A9或过表达SLC26A9后,观察结直肠癌肺转移能力。

11) 在SW48过表达稳定株、COLO201沉默稳定株中,通过WB研究SLC26A9对肿瘤细胞增殖、EMT、凋亡和CSCs的影响。以及探索SLC26A9对WNT/β-catenin信号通路的影响。

12) 通过细胞浆与细胞核蛋白提取,利用WB验证SLC26A9从细胞浆向细胞核移位并累积机制的研究。

13) 利用选择性的β-catenin抑制剂XAV-939,进一步阐明SLC26A9影响WNT/β-catenin信号通路的机制。

结果:SLC26A9在正常结直肠上皮(n=135)、增生性息肉(n=76)和腺瘤(n=106)的细胞质中表达较低,在结直肠腺癌中表达明显升高,且移位到细胞核(n=150,p<0.0001)。

此外,SLC26A9表达上调与患者不良预后相关。与正常结肠细胞系(NCM460)相比,SLC26A9在所有CRC细胞系中表达均显著上调,在COLO201细胞系中表达最高,在SW48细胞系中表达最低。在COLO201中沉默SLC26A9,可诱导细胞周期阻滞和凋亡,并在体内外抑制细胞增殖和皮下移植瘤的生长。

分子机制的研究表明,SLC26A9与β-catenin在CRC的细胞核均有表达,并从胞浆向细胞核移位,激活WNT信号通路,促进下游靶基因的转录,包括CCND1,c-Myc和Snail,但抑制细胞色素C(Cyt-C),Caspase9,Caspase3,凋亡诱导因子(AIF)和核酸内切酶G(Endo G),表明抑制Caspase依赖和非依赖的凋亡通路。

SLC26A9表达的改变导致上皮间充质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)标记物的改变,包括E-cadherin表达下调,N-cadherin表达增加,以及EMT诱导的癌症干细胞(CSC)改变,包括CD44、CD133、Lgr5、OCT4和Nanog表达上调。

结论:SLC26A9上调并移位到细胞核激活了WNT/β-catenin信号通路,导致了CRC的发生发展。SLC26A9可能是CRC新的候选癌基因。

参考文献

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[2]Mutations and mechanisms of WNT pathway tumour suppressors in cancer..Bugter Jeroen M;Fenderico Nicola;Maurice Madelon M.Nature reviews.Cancer,2020

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[4]Guidelines and definitions for research on epithelial-mesenchymal transition..Yang Jing;;Antin Parker;;Berx Geert;;Blanpain Cédric;;Brabletz Thomas;;Bronner Marianne;;Campbell Kyra;;Cano Amparo;;Casanova Jordi;;Christofori Gerhard;;Dedhar Shoukat;;Derynck Rik;;Ford Heide L;;Fuxe Jonas;;García de Herreros Antonio;;Goodall Gregory J;;Hadjantonakis Anna-Katerina;;Huang Ruby J Y;;Kalcheim Chaya;;Kalluri Raghu;;Kang Yibin;;Khew-Goodall Yeesim;;Levine Herbert;;Liu Jinsong;;Longmore Gregory D;;Mani Sendurai A;;MassaguéJoan;;Mayor Roberto;;McClay David;;Mostov Keith E;;Newgreen Donald F;;Nieto M Angela;;Puisieux Alain;;Runyan Raymond;;Savagner Pierre;;Stanger Ben;;Stemmler Marc P;;Takahashi Yoshiko;;Takeichi Masatoshi;;Theveneau Eric;;Thiery Jean Paul;;Thompson Erik W;;Weinberg Robert A;;Williams Elizabeth D;;Xing Jianhua;;Zhou Binhua P;;Sheng Guojun.Nature reviews.Molecular cell biology,2020

[5]张明林.氯离子/碳酸氢盐转运体SLC26A9在结直肠癌发生发展中的作用及分子机制研究[D].遵义医科大学,2021.