昆虫杆状病毒表达系统的应用

背景^[1-6]

昆虫杆状病毒表达系统昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统,利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体,可以使很多真核目的基因得到有效甚至高水平表达.由于hBM P3的活性形式是二聚体,中间有7个保守半胱氨酸。

昆虫杆状病毒表达系统(baculovirus expression vector system,BEVS)以昆虫杆状病毒为外源基因载体,昆虫和昆虫细胞为受体的表达系统。昆虫细胞与哺乳动物细胞翻译和翻译后蛋白修饰的模式与能力相似，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等，得到的重组蛋白抗原性、免疫原性和功能等生物活性与天然蛋白相似；能容纳大分子的插入片段；容易实现大规模低成本生产。昆虫表达系统也是一类应用广泛的真核表达系统,它具有与大多数高等真核生物相似的翻译后修饰、加工及转运外源蛋白的能力。

目前常用于表达载体构建的杆状病毒为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa ca lifornica nucleopolyhedro-virus,)AcNPV,家蚕核型多角体病毒(Bmbyxmorinucleopolyhedrovirus,BmNPV),及粉纹夜蛾核型多角体病毒(Trichoplusiani nucleopolyhedrovirus,TnNPV)。杆状病毒表达系统中的宿主细胞多用草贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9、Sf12以及商品化的High FiveTM(Trichoplusia ni,Tn-5B1-4)。昆虫杆状病毒表达载体系统(BEVS)的一个重要特性就是它能提供类似于真核生物的翻译后修饰过程。然而,鳞翅目类昆虫的糖基化途径与高等真核生物不同,一般生成高苷露糖(Man9-5 GlcNAc2)或寡甘露糖型(Man3-2GlcNAc2)糖蛋白,糖链末端极少带有半乳糖、唾液酸残基。

应用^[7][8]

昆虫杆状病毒表达系统可用于真核目蛋白的表达。

1.在昆虫杆状病毒表达系统中表达人骨形成蛋白3

方法:将h BMP3全长c DNA克隆入转移载体Bac PK8中,酶切鉴定后,将此载体与病毒DNA经脂质体包裹转染昆虫细胞,重组病毒经蓝白筛选后,提取其DNA进行PCR反应,鉴定目的基因.收集重组病毒感染5 d的细胞进行免疫荧光及电子显微镜观察.结果克隆了目的基因的重组载体经内切酶消化后,琼脂糖电泳示有相应大小的目的基因片段切下.PCR电泳结果见有目的基因片段的扩增.免疫荧光检测见阳性颗粒分布在昆虫细胞的胞质及胞膜,电镜下见重组病毒无多角体颗粒,与野生型杆状病毒完全不同。

2. 表达需要N-糖基化修饰的相关蛋白

对昆虫杆状病毒表达系统所表达的重组人血纤维蛋白溶酶原的结构分析最早提供了昆虫细胞具有产生复杂的末端唾液酸化的糖蛋白的能力。研究结果表明,Tn(Trichoplusia ni)细胞在含有N-乙酰甘露糖胺(唾液酸前体)的培养基上培养时能产生唾液酸化的糖蛋白。另一项研究发现在培养基中加入昆虫细胞B-N乙酰葡萄糖胺酶抑制剂,也同样能得到唾液酸化的糖蛋白。

这些研究表明昆虫表达体系是具备一定的复杂化糖基处理能力的,也为研究者们进一步改造其糖基化过程提供了前提条件。大量的研究表明昆虫细胞具有糖基化修饰过程所必需的A-甘露糖苷酶Ñ、Ò;B-1,2N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶Ñ、A-1,6-果糖转移酶、同时胞内有高活性的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,但是昆虫细胞缺乏B-1,4-半乳糖基转移酶及唾液酸转移酶活性。

而上述两种酶决定了能否形成复杂的带有唾液酸或半乳糖型糖链。这说明昆虫细胞含有N-多糖裁剪类型的酶,却缺乏N-多糖延长类型的酶。BEVS生产的糖蛋白具有高甘露糖或A-1,6-果糖化的三甘露糖核心结构。

参考文献

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