人BURKITT淋巴瘤细胞的应用

背景^[1-3]

人BURKITT淋巴瘤细胞是由E·Klein和G·Klein于1967年5月从一位16岁黑人男性Burkitt's淋巴瘤患者建立的。Daudi细胞表面免疫球蛋白阳性(sIg+)、Β2-微球蛋白阴性，EBNA阳性，并有衣壳抗原VCA；Daudi细胞携带EB病毒。Daudi细胞是典型的B淋巴母细胞，广泛应用于白血病发生机理的研究。

人BURKITT淋巴瘤细胞

人BURKITT淋巴瘤细胞处理：

1）冻存人BURKITT淋巴瘤细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）人BURKITT淋巴瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于悬浮人BURKITT淋巴瘤细胞，传代可参考以下方法：

悬浮状态下生长的细胞，可以通过向培养瓶中添加完全培养基来维持细胞的生长状态，一般情况下细胞密度维持在1×105~1×10^6个/mL（不同细胞对密度要求不同，）可以维持细胞的正常生长。如需分瓶可以将细胞悬液收集到离心管中1000rpm，离心5min，弃去上清，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）人BURKITT淋巴瘤细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

应用^[4][5]

人BURKITT淋巴瘤细胞可以用于miR-525-5p通过MyD88/NF-κB信号通路调控Burkitt淋巴瘤细胞生物学行为的研究

通过使用miRNA靶点分析软件Target Scan、miRDB、microcosm、Walk3.0预测分析了miR-525-5p的靶基因,结果显示,miR-525-5p能够与MyD88基因的3’-UTR结合,MyD88是一种重要的衔接蛋白,它可以激活核因子-κB(NF-κB)信号通路,介导炎性反应,在促肿瘤方面发挥着十分重要的作用。有关miR-525-5p如何影响MyD88进而发挥一系列作用尚未知晓,值得深入研究。

为更进一步了解miR-525-5p的作用,探讨miR-525-5p对BL细胞株的生物学行为的影响,分析miR-525-5p与MyD88之间的调控机制,本课题组提出假说“下调的miR-525-5p靶向作用于MyD88进而活化NF-κB信号通路可能是促进Burkitt淋巴瘤发生发展的机制之一”,检测BL中miR-525-5p miRNA和MyD88蛋白的表达水平、分析miR-525-5p对BL细胞生物学行为的影响、探讨miR-525-5p对MyD88及NF-κB信号通路的调控作用、验证MyD88是否为miR-525-5p的下游靶基因,进一步揭示miR-525-5p通过MyD88/NF-κB信号通路调控BL细胞生物学行为的机制。

研究方法提取石蜡包埋BL组织中RNA,采用Realtime RCR技术对miR-525-5p m RNA的表达进行检测;应用免疫组织化学染色检测MyD88的蛋白表达。利用慢病毒转染技术建立稳定过表达miR-525-5p的BL Raji、Ramos细胞株,借助于Realtime RCR技术检测miR-525-5p的转染效率,同时检测MyD88 m RNA的表达水平。构建稳定过表达miR-525-5p的细胞株,通过CCΚ-8法检测细胞增殖能力变化;应用Western Blot法对MyD88及NF-κB信号通路蛋白(p65、p-p65、IκBα、p-IκBα)的表达变化进行观察;应用软琼脂克隆形成实验对细胞克隆形成能力进行检测;采用Transwell法检测细胞迁移能力;通过流式细胞术了解细胞凋亡比例变化和细胞周期分布;应用流式细胞术分析在使用化疗药物的情况下,细胞凋亡比例发生的变化。最后采用双荧光素酶实验分析MyD88是否为miR-525-5p的靶基因。

研究结果BL中miR-525-5p表达下调,MyD88表达增高。过表达的miR-525-5p可以下调MyD88的表达,并抑制NF-κB信号通路;过表达的miR-525-5p能够使Raji、Ramos细胞在化疗药物上有更高的敏感性,还能使细胞的增殖、迁移、克隆形成过程受到抑制,促进细胞的凋亡,改变细胞周期。

同时验证MyD88是miR-525-5p的下游靶基因。研究结论1.miR-525-5p可以靶向结合MyD88并调控其转录。2.下调的miR-525-5p可通过MyD88活化NF-κB信号通路。3.miR-525-5p通过MyD88/NF-κB信号通路调控BL细胞的增殖、克隆形成、迁移能力,促进BL细胞的凋亡,改变BL细胞的周期,增加BL细胞对化疗药物的敏感性。

参考文献

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[2]New developments in non-Hodgkin lymphoid malignancies[J].Ganapathi Karthik A.;Brown Laura E.;Prakash Sonam;Bhargava Parul.Pathology,2021(3)

[3]Alleviation of non-alcoholic fatty liver disease by Huazhi Fugan Granules is associated with suppression of TLR4/NF-κB signaling pathway[J].Ye Miaoqing;Tang Yinghui;He Jinyu;Yang Yueqing;Cao Xueyan;Kou Shaojie;Wang Lin;Sheng Lingli;Xue Jingdong.Clínica e Investigación en Arteriosclerosis,2021(prep)

[4]MAGI2-AS3 suppresses MYC signaling to inhibit cell proliferation and migration in ovarian cancer through targeting miR-525-5p/MXD1 axis.[J].Chang Hua;;Zhang Xue;;Li Baixue;;Meng Xiangkai.Cancer medicine,2020(17)

[5]王青青.miR-525-5p通过MyD88/NF-κB信号通路调控Burkitt淋巴瘤细胞生物学行为的研究[D].大理大学,2021.