SUPB15细胞系|人急性淋白血病细胞的应用

背景^[1-3]

SUPB15细胞系人急性淋白血病细胞来源于一位B细胞全部为费城染色体阳性的8岁小孩的骨髓。SUP-B15细胞表达多个B细胞标记，但不表达T细胞标记。β-2微球蛋白、Leu12、My7(CD13)、OKT9(CD71)、OKT10(CD38)及CALLA(CD10)抗体阳性。CB1、Leu1(CD5)、Leu2(CD8)、Leu3(CD4)、Leu4(CD3)、Leu5(CD2)、Leu6(CD1a)、Leu9、LeuM1(CD15)、My9(CD33)、表面抗原(sIg-)及Epstein-Barr病毒阴性。

SUPB15细胞系人急性淋白血病细胞

SUPB15细胞系人急性淋白血病细胞接收后的操作流程与注意事项

1.SUPB15细胞系人急性淋白血病细胞收到后建议在培养箱稳定4小时左右再依据细胞密度，换液培养或传代。

2.SUPB15细胞系人急性淋白血病细胞收到时呈悬浮或者部分悬浮的状态，请将悬浮的细胞及时离心，加15%血清的完全培养基到新的培养皿/瓶中继续培养3天；同时原培养瓶中剩下的贴壁细胞更换为15%血清的完全培养基，培养2-3天。若3天后细胞都没有出现增殖而是继续脱落死亡，请及时联系实验室，技术人员会跟进解决。

3.SUPB15细胞系人急性淋白血病细胞生长缓慢：适当提高血清浓度（最高不超过20%），或可根据该细胞生长密度，考虑胰酶消化后，转移到新的培养瓶继续培养。

4.SUPB15细胞系人急性淋白血病细胞生长不均：SUPB15细胞系人急性淋白血病细胞若出现生长不均，成岛状生长，可将细胞进行消化，重新打散细胞，加入新鲜培养基进行培养。

SUPB15细胞系人急性淋白血病细胞常规培养传代流程（请严格遵守无菌操作）

1.吸出原培养瓶中的培养基，PBS缓冲液润洗SUPB15细胞系人急性淋白血病细胞两次，加1~2 ml 0.25%EDTA的胰酶消化（注意把握消化时间，通常控制在1~2min）。

2.镜下观察消化情况，在细胞边缘缩小，贴壁运动时（不建议消化到细胞漂浮）去掉胰酶，加6~8ml完全培养基，轻轻吹打细胞层，尽量把细胞层吹落、吹散。

3.取出部分SUPB15细胞系人急性淋白血病细胞悬液转移到新的培养皿/瓶中，添加适当的完全培养基，于培养箱中培养。

4.注意培养基PH值变化情况，定期换液，待细胞密度达到70-80%时重复传代操作或者冻存。

应用^[4][5]

SUPB15细胞系人急性淋白血病细胞可以用于维奈托克联合达沙替尼对白血病细胞株SUPB15增殖和凋亡的影响及相关机制的研究

探讨BCL-2抑制剂-维奈托克(VEN)、酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)达沙替尼(Dasatinib,DAS)单独去使用以及对两药进行联合使用,观察其对SUPB15细胞的增殖情况与凋亡反应及其相关机制。

方法:(1)96孔板进行体外培养的SUPB15细胞经VEN(VEN单药组)、DAS(DAS单药组)、两药联合(DAS+VEN联合用药组),进行干预,并设置不加药阴性对照组,每组设置6个重复孔,观察SUPB15细胞株24h、48h、72h,使用CCK8法测定细胞增殖抑制率。

(2) 采用流式细胞术(FCM)在48h时间节点检测DAS组、VEN组及两药联合组的凋亡情况。

(3) Q-PCR检测DAS单药组、VEN单药组及两药联合作用干预SUPB15细胞株后,相关基因BCR-ABLm RNA、BCL-2m RNA、MCL-1m RNA、LYNm RNA、BIMm RNA、STAT5m RNA、BAXm RNA表达。

(4) 采用蛋白质检测法(Western-blot)分析DAS单药组、VEN单药组及两药联合使用组对SUPB15细胞株干预后,相关蛋白BCL-2、MCL-1、STAT5、BAX、BIM、LYN蛋白的表达情况以及检测凋亡相关的标志性蛋白Cleaved-Caspase-3(CC-3)的水平。

结果:(1)CCK-8结果表明:在24h、48h、72h三个时间节点,VEN单药组(0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L),DAS单药组(0.001μmol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L)。伴随着时间延长以及浓度的增加,利用酶标仪检测到的吸光值越来越低,说明药物作用于细胞之后,细胞的存活率降低,药物对细胞的抑制率升高,且呈时间-剂量依赖性,单药作用组与联合作用组与对照组比较差异均具有统计学意义。DAS单药组在各时间点(24h、48h、72h)的IC50值分别为0.13μmol/L、0.08μmol/L、0.01μmol/L,VEN单药组在各时间点(24h、48h、72h)的IC50值分别为:1.24μmol/L、0.39μmol/L、0.07μmol/L。计算在48h VEN联合DAS(0.5μmol/L+0.1μmol/L)的q值为1.16,q值>1.15,表明两药具有协同或增敏作用。

(2)FCM结果表明:根据CCK8实验结果,选用48h时间节点,选接近IC50值的联合组研究浓度,即:DAS 0.1μmol/L、VEN 0.5μmol/L及两药联合。流式仪检测细胞凋亡率,联合用药组的平均凋亡率(57.42±0.59)%,显著高于对照组,亦高于各单药组(p<0.05),差异具有统计学意义。

(3)Q-PCR结果表明:当DAS单药组浓度为0.1μmol/L、VEN单药组浓度为0.5μmol/L及联合组浓度为0.1μmol/L DAS+0.5μmol/L VEN时,干预SUPB15细胞株48h后,相关基因BCR-ABL、LYN、STAT5、BCL-2、MCL-1 m RNA的相对表达量较对照组下降(P值<0.05,差异具有统计学意义),而BIM、BAX m RNA的相对表达量较对照组上升,联合用药组与单药组比较BCR-ABL、LYN、STAT5、BCL-2、MCL-1 m RNA的下降量及BIM、BAX m RNA的上升量更明显,差异具有统计学意义(p<0.05)。

参考文献

[1]Inhibiting Casein Kinase 2 Sensitizes Acute Lymphoblastic Leukemia Cells to Venetoclax Via MCL1 Degradation.[J].LazaroNavarro Juan;PimentelGutiérrez Helia Judith;Gauert Anton;Hagemann Anja I H;Eisenschmid Jassi Lena;Goekbuget Nicola;Vick Binje;Jeremias Irmela;Seyfried Felix;Meyer Lüder Hinrich;Debatin KlausMichael;Richter Kathrin;Bultmann Miriam;Neumann Martin;Haenzelmann Sonja;Serve Hubert;Astrahantseff Kathy;Rieger Michael A;Eckert Cornelia;Baldus Claudia D;Bastian Lorenz.Blood advances,2021

[2]An effective chemotherapy-free regimen of ponatinib plus venetoclax for relapsed/refractory Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia.[J].Short Nicholas J;Konopleva Marina;Kadia Tapan;Kebriaei Partow;Daver Naval;Huang Xuelin;Masarova Lucia;Cook Robin;Jain Nitin;Jabbour Elias;Kantarjian Hagop;Ravandi Farhad.American journal of hematology,2021(7)

[3]Chronic Myeloid Leukemia:Modern therapies,current challenges and future directions.[J].Osman Afaf E G;Deininger Michael W.Blood reviews,2021

[4]Phase 1/2 study of venetoclax,a BCL-2 inhibitor,in Japanese patients with relapsed or refractory chronic lymphocytic leukemia and small lymphocytic lymphoma.[J].Koji Izutsu;Kazuhito Yamamoto;Koji Kato;Takayuki Ishikawa;Noriko Fukuhara;Yasuhito Terui;Ilseung Choi;Kathryn Humphrey;Su Young Kim;Sumiko Okubo;Natsumi Ogawa;Yasuko Nishimura;Ahmed Hamed Salem;Dai Maruyama.International journal of hematology,2020(prep)

[5]刘元艺.维奈托克联合达沙替尼对白血病细胞株SUPB15增殖和凋亡的影响及相关机制的研究[D].山西医科大学,2022.