人肾癌细胞的应用

背景^[1-3]

人肾癌细胞该细胞系1975年建系，源自一位63岁白人女性的初期透明细胞腺癌组织，细胞呈圆形且边界不清，核浆比大，有微绒毛及桥粒。该细胞可在软琼脂上生长。

人肾癌细胞

人肾癌细胞处理：

1）复苏人肾癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）人肾癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁人肾癌细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议客户冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

3）人肾癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为类；

1，细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2，4min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x10E6/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3，将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。

应用^[4][5]

人肾癌细胞可以用于Kruppel样因子8通过上调FLT1促进769-P肾癌细胞株体外增殖

在肾透明细胞癌细胞系786-O细胞株中瞬时敲低Kruppel样因子8(Kruppel like factor 8,KLF8)的表达能够抑制786-O细胞系的增值,但KLF8在肾癌中的作用机制并不清楚,既往的研究表明,在肾癌中VHL突变导致的VEGF/VEGFR、PDGFβ/PAGFRβ、TGF/EGFR过度激活,在肾癌的发生发展中起重要作用,本研究旨在探讨过表达KL8基因对肾透细胞癌细胞系769-P的增值能力的影响,以及该作用是否与上述经典通路有关,其作用靶点是什么。

方法：应用慢病毒包装系统构建重组KLF8质粒,与空载体质粒分别转染293V细胞进行病毒包装,再分别感染769-P细胞株,利用实时荧光定量PCR技术(Real TimePCR)及Western blot技术检测769-P细胞KLF8的表达情况。根据769-P细胞感染重组KLF8慢病毒或空载体将其分为两组进行功能实验,用平板克隆实验及MTS方法检测769-P细胞增殖能力的变化,应用流式细胞学技术检测细胞周期变化。

应用Western blot技术检测潜在靶基因在过表达KLF8组和转染空质粒组中的表达情况。应用siRNA(small interference RNA)技术敲低FLT1后根据FLT1蛋白表达量筛选出敲低效果最明显的siRNA。分别在转染pLV-EGFP(2A)Puro-KLF8质粒和pLV-EGFP(2A)Puro空载体质粒的769-P细胞中转染siFLT1,再应用平板克隆实验,MTS实验检测769-P细胞株增殖能力的变化。

结果：①成功筛选出高表达KLF8基因的769-P细胞株,转染pLV-EGFP(2A)Puro-KLF8组的KLF8蛋白表达较对照组显著上调。

②平板克隆实验：转染pLV-EGFP(2A)Puro-KLF8组较空载体组克隆数明显增多(P<0.05).

③MTS实验，在48h、72h、96h的检测中,实验组在490nm吸光值显著升高(P<0.05)。

④流式细胞学检测细胞周期,转染pLV-EGFP(2A)Puro-KLF8组G0/G1细胞比例明显减少S期细胞比例增加。

⑤Western blot检测发现FLT1在实验组中表达显著上升。

⑥应用siFLTl敲低FLT1后,769-P细胞株的增值能力明显下降,平板克隆实验：769P-KLF8+control克隆数最多,769P-KLF8+siFLT1与769P-EMPTY+control组次之，769-P-EMPTY+siFLT1克隆数最少;MTS:769P-KLF8+control组于72h,96h时间点在490nm处光吸收值最高,769P-KLF8+siFLT1与769P-EMPTY+control组次之，769-P-EMPTY+siFLT1最低(P<0.05)。

结论：KLF8基因过表达能够促进肾透明细胞癌细胞系769-P的增值,并且该增值效应依赖于FLT1(即VEGFR1)的表达升高。

参考文献

[1]MiR-135a inhibits migration and invasion and regulates EMT-related marker genes by targeting KLF8 in lung cancer cells[J].Hongyang Shi;;Yuqiang Ji;;Dexin Zhang;;Yun Liu;;Ping Fang.Biochemical and Biophysical Research Communicatio,2015(1)

[2]Suppression of KLF8 induces cell differentiation and sensitizes colorectalcancer to 5-fluorouracil[J].Xinpeng Shi;;Xiaoyong Luo;;Qingqing Yan;;Wenjing Zhang;;Yao Wu;;Mengnan Zhang;;Jinjun Zhao;;Ying Peng;;Ye Chen;;Yali Zhang;;Cunlong Chen;;Tianming Cheng;;Chudi Chen;;Side Liu;;Yang Bai;;Jide Wang.Oncology Reports,2015(3)

[3]Krüppel‐like factor 8 contributes to hypoxia‐induced MDR in gastric cancer cells[J].Hui Zhang;;Li Sun;;Xiao Xiao;;Rougang Xie;;Changhao Liu;;Yafang Wang;;Yanling Wei;;Hongbo Zhang;;Lili Liu.Cancer Sci,2014(9)

[4]KLF8 knockdown suppresses proliferation and invasion in human osteosarcomacells[J].Feng Lin;;Zan Shen;;Li?Na Tang;;Shui?Er Zheng;;Yuan?Jue Sun;;Da?Liu Min;;Yang Yao.Molecular Medicine Reports,2014(5)

[5]孟庆禹.Kruppel样因子8通过上调FLT1促进769-P肾癌细胞株体外增殖[D].中国人民解放军医学院,2016.