台盼蓝与细胞计数

台盼蓝(Trypan Blue)是组织和细胞培养中最常用的死细胞鉴定染色方法之一。正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，细胞不被染色；而死细胞的胞膜不完整，通透性增加，可使台盼蓝渗入将细胞染成蓝色。因此，借助台盼蓝染色可以简单、快速地区分活细胞和死细胞。

台盼蓝染色法的局限性，以及当前最受认可的AO/PI荧光染核法的原理和优越性。

台盼蓝浓度

用台盼蓝染细胞时应该用什么浓度？回答五花八门：有将0.4% （4 g/100 ml)）台盼蓝溶液和细胞1：1混合的（稀释2倍），有1：9混合的（稀释10倍），还有把台盼蓝原液当稀释液，想加多少就加多少的……

目前台盼蓝染细胞的浓度并没有可参照的标准，各实验室都是根据产品说明书或习惯自行制定。可是不同浓度的台盼蓝会对细胞产生不同的染色效果吗？

Nexcelom的科学家们将同一Jurkat细胞样本与0.4%，0.2%，0.1%，0.05%和0.025%的台盼蓝以1：1比例混合，以下是部分浓度染色后的细胞图片：

从图中我们可以发现，0.4%和0.1%台盼蓝（终浓度分别为0.2%和0.05%）染上的细胞比0.025%（终浓度为0.0125%）台盼蓝更多，即检测出更多死细胞。此外，0.4%台盼蓝染色的样本中“气球”状形态的细胞明显比其他浓度更多。下面的直方图统计了不同浓度台盼蓝下的死细胞（较深着色）和“气球”状细胞的浓度。

由此可见，不同浓度的台盼蓝会产生不同的细胞染色效果。高浓度的台盼蓝更容易使死细胞破裂产生“气球”，而当“气球”颜色特别浅的时候容易被漏数。低浓度的台盼蓝不会产生“气球”状细胞，但过低的浓度可能不足以染上所有死细胞，使得检测不够灵敏。这两种情况都会导致死细胞被低估，即存活率被高估。Nexcelom公司建议所有Cellometer用户使用0.2%的台盼蓝和细胞样本1：1混合后（终浓度0.1%）上机检测。

为了进一步研究不同浓度台盼蓝对细胞形态产生的影响，研究者分别用明场光学显微镜和相差显微镜对0.4%和0.1%台盼蓝染色的细胞进行拍照。

0.4%台盼蓝染色的光学显微镜图片中有一个浅色的“气球”状细胞，然而这个细胞在相差显微镜下是观察不到的，说明该细胞不具备折射光的能力，已经失去了细胞结构。0.1%台盼蓝染色的光学显微镜图片中有一个深色的死细胞，该细胞在相差显微镜中依然可以被显示，说明其仍具备细胞结构。这个实验进一步证明了上一节的“Hold”不住假设。

台盼蓝染色时间

台盼蓝是一种具有毒性的化学染料，若染色时间过长除了死细胞也会渗入活细胞，降低细胞的存活率。Mascotti等人在2000年发表的一篇文献中专门研究了台盼蓝和AO/PI对细胞的毒性。作者们将HPC细胞和0.4%台盼蓝或AO/PI染料混合后放置在室温。在此后的2小时测量时间中，前一小时每隔10分钟取一次样计数，后一小时每隔15分钟取一次样计数。

上图记录了每个时间点两种方法测得的存活率。AO/PI（实心点）染色的细胞在2小时区间内始终保持很高的存活率（~98%），而台盼蓝（空心点）染色的细胞存活率从96.2%降到了89.8%。由此可见AO/PI对细胞的毒性非常小，而台盼蓝对细胞的毒性在2小时内已经十分明显。所以台盼蓝染色后需要尽快完成细胞计数，一般建议不要超过10分钟。