人结肠癌细胞的应用

背景^[1-3]

人结肠癌细胞构建于1971年，来源于一名56岁的白人男性结直肠癌患者转移到左锁骨位置的一个肿瘤结节。CSAp和结肠抗原3(colon antigen 3)表达阴性。肿瘤基因c-myc、K-ras、H-ras、N-ras、Myb.sis和fos表达阳性但未检测到N-myc表达。该细胞表达肿瘤特定的核基质蛋白CC-3和CC-4。

人结肠癌细胞

人结肠癌细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备F-12K培养基（F-12K，GIBCO,货号21127-022），90%；优质胎牛血清，10%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

人结肠癌细胞可以用于miRNA-449a对人结肠癌细胞SW480、LoVo迁移及增殖的影响

构建miRNA-449a模拟物及抑制物模型探究其对人结肠癌细胞LoVo、SW480迁移及增殖能力的影响,为miR-449a在结肠癌细胞层面上的研究提供部分数据,在结肠癌临床的早期诊断、有效治疗及预后评估上提供一定理论依据。

方法：对人结肠癌细胞系HT-29、HCT-15、LoVo、SW480及人正常结肠上皮细胞NCM-460进行培养,通过实时定量PCR技术检测各组细胞中的miRNA-449a表达水平。根据结果从中选取差异较大的LoVo、SW480两组细胞,将上述两种细胞进行培养并均分为4组:分别转染miR-449a mimics、miR-449a mimics、NCmiR-449a inhibitor和miR-449a inhibitor NC构建miRNA-449a模拟物和抑制物模型及其相应NC模拟物。

构建模型成功后,使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖状况、通过细胞划痕实验检测细胞迁移能力,探究miRNA-a449对人结肠癌细胞LoVo、SW480的迁移及增殖的影响。通过Western blot实验检测增殖相关抗体蛋白β-catenin、迁移相关抗体蛋白E-Cadherin的表达情况。

结果：对比人正常结肠上皮细胞,miR-449a在人结肠癌细胞HT-29、HCT-15、SW480及LoVo中均呈现低表达,其中以SW480和LoVo细胞表达量最低;通过构建miRNA-449a模拟物模型后发现,结肠癌细胞LoVo和SW480的细胞增殖、迁移能力减弱,而在miRNA-449a抑制物模型中结肠癌细胞的增殖、迁移能力有所增加;Western blot实验结果显示,在模拟物模型中增殖相关蛋白β-catenin、迁移相关蛋白E-Cadherin的表达受抑制,而在抑制物模型中增殖相关蛋白β-catenin、迁移相关蛋白E-Cadherin的表达有所增强。

结论：转染miRNA-449a模拟物或抑制物后可在一定程度上影响结肠癌细胞的增殖和迁移能力,且该作用效果对LoVo细胞更显著。

参考文献

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[3]Lung cancer incidence trends in Uruguay 1990–2014:An age-period-cohort analysis[J].Rafael Alonso;;Marion Pi?eros;;Mathieu Laversanne;;Carina Musetti;;Mariela Garau;;Enrique Barrios;;Freddie Bray.Cancer Epidemiology,2018

[4]MicroRNA-223-3p regulates cell chemo-sensitivity by targeting FOXO3 in prostatic cancer[J].Qiang Feng;;Peng He;;Yu Wang.Gene,2018

[5]马煜.miRNA-449a对人结肠癌细胞SW480、LoVo迁移及增殖的影响[D].华北理工大学,2020.