细胞分离液的应用

背景^[1-3]

细胞分离液属于生化试剂，利用细胞分离液对机体细胞标本进行前处理，以获取所需要的细胞标本。

细胞分离液是一种经过聚乙烯吡咯烷酮处理过的硅胶颗粒,经过高速离心后可形成连续密度梯度,由于细胞分离液扩散常数低,所形成的梯度十分稳定。细胞分离液采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200~1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。此外,细胞分离液不穿透生物膜,对细胞无毒害,因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒,还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。细胞分离液常用于分离和传话植物原生质体、核、叶绿体、和线粒体。

细胞分离液

操作方法及注意事项

1.不同浓度（密度）细胞分离液溶液的制备:先用9份细胞分离液与1份8.5％NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液（0.85％NaCl或0.15M PBS）稀释到所需浓度。

2.不连续密度梯度细胞分离液层的制备:先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的细胞分离液液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层细胞分离液比重相差不大时，可将细胞分离液液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。

3.装样：样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。

4.离心：一般采用离心力为400g，时间20～25min。由于多层细胞分离液之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。

5.取样：当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除细胞分离液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于Percoll层中,则需要逐层收集。收获含有细胞分离液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。

应用^[4][5]

细胞分离液可以用于单个核细胞分离及CIK细胞诱导培养的方法优化

通过收集脐带血样本,研究单个核细胞得率和纯度以及CIK细胞得率,优化单个核细胞分离方案,并系统性地优化CIK细胞制备方案。

主要完成以下工作。1.建立脐带血样本库。根据脐带血血量的不同,选择性地收集新生儿脐带血样本近30例,其中脐带血血量不超过50 m L的样本10例,血量在50 m L至100m L之间的样本10例,血量大于100 m L的样本10例。将以上样本进行分组,考察不同样本量对单个核细胞分离的影响,为后续分离条件优化及CIK细胞诱导条件优化奠定了坚实的基础,具有重要意义。

2. 采用密度离心法收集脐带血中单个核细胞。发现Ficoll-PaqueTM PLUS对单个核细胞分离效果优于Nyco PrepTM 1.077,与DH分离介质的分离效果无明显差异;按照稀释脐血样本与分离液1:1的比例铺血,采用800×g,15 min的离心参数,能够减少时间成本;脐带血血量与血液保存液比例越大,单个核细胞的得率和纯度越高。

3.采用CIK细胞诱导培养,在6孔板内加入3*10^6细胞,加入含1000 U/m L INF-γ无血清培养基,37℃,5%CO2培养24 h,加入50 ng/m L anti-CD3、300U/m L IL-2,继续培养,3天后,进行传代,每孔接种细胞3*10^6个,补充IL-2至300 U/m L。分别在第6天和第14天对CIK细胞进行流式分析,发现脐带血血量与血液保存液比例对诱导培养后的CIK细胞纯度无明显影响。以上结果表明羟乙基淀粉和泛影酸钠组合的分离液,更容易实现临床治疗用途,在采集脐带血时,提高脐带血血量与血液保存液比例,可以提高单个核细胞的得率和纯度,进而诱导培养出更多的CIK细胞用于治疗,能够明显改善治疗效果,对临床应用有重大意义。

参考文献

[1]Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer:a phase II clinical study.[J].Li Runmei;;Wang Changli;;Liu Liang;;Du Chunjuan;;Cao Shui;;Yu Jinpu;;Wang Shizhen Emily;;Hao Xishan;;Ren Xiubao;;Li Hui.Cancer immunology,immunotherapy:CII,2012(11)

[2]Adoptive Immunotherapy with Cytokine-Induced Killer Cells for Patients with Relapsed Hematologic Malignancies after Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation[J].Ginna G.Laport;;Kevin Sheehan;;Jeanette Baker;;Randall Armstrong;;Ruby M.Wong;;Robert Lowsky;;Laura J.Johnston;;Judith A.Shizuru;;David Miklos;;Sally Arai;;Jonathan E.Benjamin;;Wen-Kai Weng;;Robert S.Negrin.Biology of Blood and Marrow Transplantation,2011(11)

[3]Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses:position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society.[J].Mallone R;;Mannering S I;;Brooks-Worrell B M;;Durinovic-BellóI;;Cilio C M;;Wong F S;;Schloot N C.Clinical and experimental immunology,2011(1)

[4]Feasibility and Safety of Adoptive Immunotherapy with CIK Cells after Cord Blood Transplantation[J].Martino Introna;;Alice Pievani;;Gianmaria Borleri;;Chiara Capelli;;Alessandra Algarotti;;Caterina Micò;;Anna Grassi;;Elena Oldani;;Josée Golay;;Alessandro Rambaldi.Biology of Blood and Marrow Transplantation,2010(11)

[5]王冬明.单个核细胞分离及CIK细胞诱导培养的方法优化[D].北京工业大学,2019.